Bacillus-derived AHL lactonases attenuate PirAB toxin expression in Vibrio parahaemolyticus AHPND via quorum quenching

Abstract

Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND)은 전 세계 새우 양식 산업에서 높은 폐사율을 유발하는 주요 질병으로, 특히 Vibrio parahaemolyticus에 의해 생산되는 PirABvp 독소에 의해 유발된다. V. parahaemolyticus는 quorum sensing을 통해 발병인자를 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 Bacillus 종에서 유래된 AiiA 및 YtnP라는 acyl-homoserine lactone(AHL)을 가수분해하는 효소(AHL lactonase)가 AHPND를 유발하는 V. parahaemolyticus의 quorum sensing 시스템과 발병인자, 특히 PirABvp 독소 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하는 것을 목적으로 한다.총 15주의 Bacillus 균주를 새우의 장과 간췌장에서 분리하여, 두 가지 quorum sensing 바이오센서인 Chromobacterium violaceum CV026과 Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)를 이용한 streak assay로 quorum quenching 활성을 선별하였다. 선택된 Bacillus 균주의 전체 whole genome sequence로부터 quorum quenching에 관여하는 AHL lactonase 유전자를 확인하였고, 이를 pET28a+ 벡터를 사용해 E. coli BL21 (DE3)에 클로닝하였다. 1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하고, SDS-PAGE, western blotting, LC-MS/MS 데이터베이스 매칭을 통해 재조합 단백질을 확인하였다. 재조합 AHL lactonase를 발현한 E. coli BL21 (DE3) lysate를 V. parahaemolyticus와 반응시킨 후 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하여 실시간 qPCR을 통해 AHPND 관련 독소 유전자의 발현을 분석하였다. 추가적으로, AiiA를 생산하는 B. cereus를 횐다리새우에 8일 동안 급여한 후 VpAHPND 감염시켰고, 새우의 폐사율을 12시간 간격으로 관찰하였다. 그 결과, AiiA와 YtnP 효소는 Vibrio 종의 종내 quorum sensing 신호분자인 AHL을 광범위하게 분해할 뿐만 아니라, V. parahaemolyticus의 pirABvp 독소 유전자 발현을 효과적으로 억제하는 시너지 효과를 보였다. 이는 V. parahaemolyticus의 quorum sensing 시스템을 방해하는 것이 AHPND를 제어하는 유망한 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 또한, B. cereus를 이용한 생균제 실험 결과, 고농도의 VpAHPND에 감염된 Penaeus vannamei의 폐사율이 유의미하게 감소하였습니다. 본 연구는 quorum quenching이 새우 양식에서 AHPND를 효과적으로 감소할 수 있는 전략임을 강조한다.|Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND), a major cause of high mortality in shrimp aquaculture worldwide, is triggered by Vibrio species, especially Vibrio parahaemolyticus, through the production of the PirABvp toxins. V. parahaemolyticus has been known to regulate its virulence factors through quorum sensing. This study aims to investigate the impact of the acyl-homoserine lactone hydrolyzing enzymes (AHL lactonases), known as AiiA and YtnP, derived from Bacillus species, on the quorum sensing system and virulence factors of AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, specifically targeting the expression of PirABvp toxins. A total of 15 strains of Bacillus spp. were isolated from shrimp gut and screened for quorum-quenching activity using streak assays with two quorum-sensing biosensors, Chromobacterium violaceum CV026 and Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4). The AHL lactonase genes responsible for quorum quenching were identified from the whole genome sequences of the selected Bacillus spp. and cloned into E. coli BL21 (DE3) using the pET28a+ vector. Protein expression was induced with 1 mM IPTG and recombinant protein identity was confirmed through SDS-PAGE, western blotting, and LC-MS/MS DB matching. E. coli BL21 (DE3) lysates containing the recombinant AHL lactonases were incubated with V. parahaemolyticus for 24 hours, followed by RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time qPCR to assess the expression of AHPND-related toxin genes. Additionally, white-leg shrimps were fed with B. cereus which produces AiiA, over an 8-day feeding period prior to immersion challenge with VpAHPND. Shrimp mortality rate was monitored every 12 hours until the end of experiment. The results demonstrate that the quorum-quenching enzymes AiiA and YtnP are able to not only degrade a broad spectrum of AHL, the intraspecies quorum sensing signaling molecules of Vibrio species, but also induce significant synergistical effects in downregulating pirABvp toxins’ gene expressions of V. parahaemolyticus. These results indicate that disruption of V. parahaemolyticus’ quorum sensing system could serve as a promising strategy for controlling AHPND in shrimp aquaculture. In vivo B. cereus probiotic treatment was able to significantly reduce the mortality rate of Penaeus vannamei challenged with high concentrations of VpAHPND. These results highlight the potential of quorum quenching as an effective strategy for controlling AHPND in shrimp aquaculture.