Engineering Live Biotherapeutic Products for Gastrointestinal Delivery via Designed Antimicrobial Peptides

Abstract

기존 항생제의 광범위한 사용은 내성균의 출현과 장내 미생물 불균형을 야기하 며, 이는 새로운 전략의 필요성을 요구한다. 항균 펩타이드는 항생제와 다른 새로 운 작용 기전을 통해 항생제 내성균에 대한 유망한 대안으로 부상하고 있으나, 합 성 펩타이드의 높은 생산 단가, 생체 내 불안정성과 표적 부위로의 효율적인 전달 등의 문제점이 존재한다. 따라서, 본 연구에서는 위의 문제점을 해결하기 위해 항 균 펩타이드의 합성 공장이자 위장관 내로 운반체로써 프로바이오틱스인 Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000을 Engineering해 새로운 생균치료제 를 개발하고자 한다. 낙지 유래 항균 펩타이드인 Octominin을 기반으로 Alpha-helix 구조를 유지하 면서 크기가 작고 소수성이 강한 AMP를 디자인하였다. L. lactis subsp. cremoris NZ9000과 비교했을 때 AMP1과 AMP3을 발현하는 Engineered L. lactis NZ9000 은 그람 양성 병원균인 Bacillus cereus KCTC 1012, Listeria monocytogenes KCTC 3569, Staphylococcus aureus KCTC 6538에 대해 항균효과를 보였으며, AMP1이 AMP3보다 더 강한 항균효과를 보였다. 연속 희석으로 MIC와 억제 구역 의 지름 측정한 결과, L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus 순으로 항균효과가 강했으며, AMP1에 대해 6.1 × 104 CFU/ml, 9.3 × 107 CFU/ml, 7.5 × 108 CFU/ml 의 MIC를 보였으며 AMP3에 대해 6.8 × 104 CFU/ml, 1.5 × 108 CFU/ml, 1.25 × 109 CFU/ml의 MIC를 보였다. 장 상피세포에 대한 무결성을 TEER와 RT-qPCR 로 확인한 결과, Control과 비교해서 AMP1과 AMP3을 발현하는 Engineered L. lactis NZ9000 모두 장 상피세포에 유의미한 영향을 주지 않았다. 따라서, AMP1과 AMP3을 발현하는 Engineered L. lactis NZ9000 항균효과를 가지며, 항생제 대체제인 합성 펩타이드의 문제점을 보완하여 위장관 내로 전달해 병원균 매개 질병을 치료할 수 있는 LBPs의 잠재성을 가지는 것을 시사한다.|The widespread use of existing antibiotics has led to the emergence of resistant bacteria and dysbiosis in the gut, which calls for the need for new strategies. Antimicrobial peptides have emerged as promising alternatives to antibiotic-resistant bacteria with novel mechanisms of action different from antibiotics, but there are problems such as high production costs of synthetic peptides, in vivo instability, and inefficient delivery to target sites. Therefore, in this study, we aimed to develop a new Live Biotherapeutic Products by engineering Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000, a probiotic, as a synthetic factory for antimicrobial peptides and a carrier into the gastrointestinal tract to solve the above problems. We designed a small, highly hydrophobic AMP that maintains an alpha-helix structure using Octominin, an antibacterial peptide derived from Octopus minor. Engineered L. lactis expressing AMP1 and AMP3 showed antibacterial effects against Gram-positive pathogens Bacillus cereus KCTC 1012, Listeria monocytogenes KCTC 3569, and Staphylococcus aureus KCTC 6538, compared to L. lactis subsp. cremoris NZ9000, and AMP1 showed a stronger antibacterial effect than AMP3. As a result of measuring the MIC and the diameter of the inhibition zone by serial dilution, the antibacterial effect was strong in the order of L. monocytogenes, S. aureus and B. cereus, and the MIC for AMP1 was 6.1 × 104 CFU/ml, 9.3 × 107 CFU/ml, and 7.5 × 108 CFU/ml, and the MIC for AMP3 was 6.8 × 104 CFU/ml, 1.5 × 108 CFU/ml, and 1.25 × 109 CFU/ml. As a result of confirming the integrity of intestinal epithelial cells by TEER and RT-qPCR, neither Engineered L. lactis NZ9000 expressing AMP1 nor AMP3 had a significant effect on intestinal epithelial cells compared to the control. Therefore, Engineered L. lactis expressing AMP1 and AMP3 has antibacterial effects and has the potential to be delivered into the gastrointestinal tract to treat pathogen- borne diseases by complementing the problems of peptides as antibiotic substitutes.