Studies on the Development of 3D In Vitro Culture Systems for Gonadal Cells in Teleost Fishes

Abstract

어류의 생식선줄기세포는 유전정보를 다음 세대로 전달하는 중요한 세포로 종 보존, 형질 전환 어류 생산, 양식품종 개량 등에 핵심적인 역할로 활용될 수 있다. 현재까지 어류에서 생식선줄기세포는 2차원 배양으로 진행되었으나, 이러한 방식은 생식소의 세포 미세환경을 재현하기 어려워 생식세포의 분화 및 기능 유지에 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 세포 기반 3차원 응집체 배양이 주목받고 있으며, 생식세포와 체세포 간 상호작용을 구조적으로 모사하고 기능을 유지할 수 있는 모델로 평가되고 있다. 그러나 어류에서 이러한 연구는 아직 초기 단계에 머물러 있으며, 응집체 유도 방법, 적절한 배지 조성, 기능적 평가 지표 등에 대한 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 생물학적 모델 어류인 바다송사리(Oryzias dancena)와 국내 양식어종인 넙치(Paralichthys olivaceus)의 3차원 응집체 유도 및 배양조건에 대해 조사하였다. 먼저, 어류에서 정소 응집체를 유도하기 위해서 Matrigel suspension, 3-layer gradient system, 그리고 ultra-low attachment 96 well plate (ULA)를 활용해 정소 응집체 형성을 평가하였다. 그 결과, ULA에 배양하는 것이 응집체 형성에 효율적이라는 것을 확인하였다. 이 후, basic medium (BM)과 modified ESM2 (mESM2)가 정소 응집체의 형태, 생존율, 기능 유전자 발현에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과 온전한 mESM2 배지가 조밀하고 생존율이 높은 응집체 형성, 생식세포 및 체세포 유전자 발현 증가, 응집체 수 및 크기 유지에 필수적인 요인임을 확인하였다. 최종적으로 확립된 배양조건을 통해 배양된 정소 응집체로부터 유도된 정자는 수정능이 있음을 확인하였다. 바다송사리 난소 응집체를 유도하기 위해서 Percoll 밀도기울기차 원심분리법으로 분리한 두 종류의 세포 군집을(총 6개 Percoll 층에서, 1-4층 및 2-3층에서 각각 회수된 난소세포 군집) ULA에 배양하고 성장인자 및 첨가물 4종(bFGF, GDNF, FS, EE),이 그리고 FSH가 난소 응집체 배양에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 1-4층에서 회수된 난소세포 군집이 재현성 있게 단일 응집체로 형성이 되었으며, bFGF, FS, EE는 scp3 유전 자 발현을 유의적으로 높여준다는 것을 확인하였다. 한편, bFGF와 GDNF를 단일 혹은 복합으로 처리하였을 때, nanos2 유전자 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 그러나, GDNF는 scp3 유전자를 유의적으로 억제 하는 것을 확인하였다. 또한, hFSH를 첨가여부와 상관없이 유도된 난소 응집체는 22일간 난모세포를 유지함과 동시에 E2를 생산하고 있음을 확인하였다. 넙치의 정소 유래 세포를 사용하여 3차원 공배양을 통해 정소 응집체를 유도하기 위해서, 정소 유래 OFT 세포주의 확립과 특성분석을 진행하였고, 확립된 세포주와 성호르몬 및 성장인자가 응집체에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, OFT는 넙치 수컷의 Sertoli 세포에서 유래된 세포주로 확인되었으며, 안정적으로 배양되고 있음을 확인하였다. 확립된 세포주는 정소 세포가 24시간 내에 응집체를 형성하는데 중요한 역할을 하였으며, 성호르몬 및 성장인자 처리는 생존율에는 영향을 미치지 않았으나, plzf와 scp3 유전자 발현의 유의적인 증가를 유도하였다. 본 연구 결과들은 어류 생식선 줄기세포의 배양 및 분화를 위한 기초연구의 기반이 될 수 있을 것으로 생 각하며, 향후 어류 번식생물학, 생식세포 공학 및 대리모 기술 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.