Baculovirus/insect cell 발현 시스템을 이용한 대하의 WSSV 방어능 연구

Abstract

White Spot Syndrome Virus(WSSV)는 새우 양식에 강력한 병원체로 작용하여 높은 치사율을 일으키는 봉입체의 원형 바이러스이다. WSSV는 새우 양식 산업에 있어서 급속도로 퍼지는 바이러스이나 아직까지 WSSV를 확실히 제어하기 위한 방법은 개발되어 있지 않은 실정이다. 무척추동물인 새우류에서는 후천성면역반응(adaptive immune response)이 결여된 것으로 알려져 왔으나, 1980년대 말부터 백신 투여에 의해 양식 새우의 vibriosis를 예방하였다는 연구결과들이 보고되고 있다. 이것은 새우에 있어서도 척추동물과는 다른 특이적 항원(specific pathogen)을 인식하여 기억할 수 있는 후천성면역반응(adaptive immune response)이 존재함을 시사하며, 이는 새우류에 있어서도 백신의 개발이 가능함을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 WSSV의 구조 단백질을 발현시켜 WSSV에 대한 백신 개발에 목표를 두고 연구하였다. 먼저 감염된 새우로부터 WSSV를 분리한 후 주사전자현미경(Transmission electron microscope, TEM)으로 그 구조를 확인하였다. WSSV의 구조 단백질을 coding하는 DNA fragment VP19와 VP466 gene을 정제된 바이러스로부터 PCR을 통해 증폭하였고 PCR product인 VP19와 VP466을 pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, USA)에 cloning 한 후 염기서열을 분석하였다. 이것을 Baculovirus/ insect cell expression system을 이용하여 pFastBac vector에 subcloning하였고 최종적으로 insect cell(SF21)에 transfection하였다. 재조합 단백질 VP19와 VP466의 최적 발현조건을 잡기 위해서 MOI(Multiplicity of infection)를 0.5에서 10까지 다양한 조건에서 실험한 결과 VP19는 MOI 3에서 VP466은 MOI 5에서 5일 배양조건에서 가장 잘 발현되었다. 재조합 단백질을 12% SDS-PAGE gel에서 확인한 결과 재조합 단백질 VP19는 20kDa, VP466은 50kDa의 크기를 확인하였다. 재조합 단백질의 WSSV에 대한 in vivo 면역효과를 검증하기 위하여 체장 9-11cm의 대하새우(Penaeus chinenesis)를 준비하였고 공식을 피하기 위해 한 마리씩 개별로 분리해두었다. In vivo test를 위해 stock한 WSSV를 100~106배 희석하여 그룹당 10마리씩 준비하여 30-G syringe를 이용하여 마리당 10㎕ 씩 감염시켰으며 그 결과 104배 희석한 바이러스를 추후 실험용 WSSV 농도로 결정하였다. 재조합 단백질의 면역효과를 검증하기 위해 rVP19와 rVP466 각각 50㎕를 그룹당 15마리 새우에 주사하였으며(injection) 일주일 뒤 104 희석한 WSSV 10㎕를 PBS 40㎕와 혼합하여 공격실험을 수행하였다. 그 결과 positive group은 바이러스 감염 후 12일에 100% 사망률을 보였고 rVP19 그룹과 rVP466 그룹은 각각 50.2%, 51.8% 의 사망률을 보였다. Oral delivery 실험으로 재조합 단백질 rVP19와 rVP466 각각을 상업용 새우사료와 재조합 단백질의 흡수를 돕기위해 FCA (Freund's Complete Adjuvant)와 섞어서 건조시킨 후 10일 동안 새우에 섭이시킨 뒤 30-G syringe를 이용하여 WSSV를 감염시켰다. 그 결과 positive control은 challenge 6일째 100%의 사망률을 보였고 rVP19와 rVP466 그룹은 challenge 15일 째 각각 49.2% 와 89.2%의 사망률을 보였다. 항체에 의한 중화반응 실험으로 his-tag affinity column을 이용하여 정제한 rVP19를 2.5-3.0kg의 토끼에 주사하여 rVP19에 대한 항체를 생성하였다. 생성된 항체와 WSSV를 섞어 주사한 후 WSSV에 대한 중화반응 실험결과 항체 농도가 높을수록 사망률이 낮아지는 것을 확인하였다. 본 실험으로 새우의 면역 시스템이 WSSV 구조 단백질을 인식할 수 있음을 확인하였고 이것은 WSSV에 대한 백신처리가 가능함을 보여주었다. 본 실험을 통하여 WSSV에 대한 후천성 면역반응체계(adaptive immune response system)가 결여된 것으로 알려진 새우의 병원체에 대한 면역반응을 제어할 수 있다는 사실을 제시하였다.