Development of Protein Vaccine against Rock Bream Iridovirus (RBIV)

Abstract

이리도바이러스(Iridovirus)는 돌돔을 포함하는 20여종의 어류에 심각한 병증을 초래하는 병원체로 알려져 있으며 돌돔이리도바이러스(Rock Bream Iridovirus, RBIV)는 대표적으로 돌돔 (Oplegnathus fasciatus)에 감염되는 어류 병원성 바이러스이다. 국내 양식산업에서 바이러스 감염으로 인한 경제적인 손실 초래에도 불구하고 RBIV 백신에 대한 연구는 거의 이루어져있지 않았으며 또한 어류 이리도바이러스의 항원 분석에 대해서도 연구가 미진한 상태이다. 본 연구에서는 RBIV에서 막단백인 유전자로 ORF 001L, ORF 017L, ORF 026R, ORF 032L, ORF 049L, ORF 107을, ankyrin repeats 유전자로 ORF 112L을, major capsid 단백질 유전자인 ORF 007L, epidermal growth 인자와 유사한 ORF 023R로 RBIV를 제어하기 위한 단백질 백신 개발을 위한 유전자로 사용하여 연구를 하였다. 실험에 사용한 바이러스는 정십이면체로 이리도바이러스의 특징적인 120-130 nm의 크기로 RBIV임을 확인할 수 있었다. 선별한 유전자는 PCR을 통하여 pGEM-T-Easy 벡터 시스템에 cloning하여 염기서열을 분석한 결과 NCBI에 등록된 RBIV Korea type I과 85% 이상의 높은 상동성을 보였다. 선별된 유전자를 발현 벡터인 pET-28a 및 pGEX-4T-1에 클로닝하여 E.coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 발현유무를 확인하였으며 총 9개의 유전자 중 6개의 유전자가 발현됨을 확인하였다. 발현된 단백질은 affinity chromatography를 이용해서 정제하여 BALB/c mice와 New Zealand white rabbit에 주사하여 항체를 생산하였다. Western blot 및 ELISA를 통해 생성된 항체들이 항원과 반응하는 것을 확인하였고 이를 통하여 항체가 성공적으로 만들어진 것을 확인하였다. 선별된 항원에서 생성된 항체의 효능을 검증하기 위해 어류 세포주인 bluegill fry-2 (BF-2) cell을 이용한 in vitro test를 수행하였다. 먼저 돌돔에서 분리한 RBIV를 BF-2 cell에 접종하여 2∼3 일만에 cytopathic effect (CPE)를 확인하였고, 확인된 바이러스는 생성된 항체와 반응시켜 중화반응을 실시하였다. 그 결과 GST-049 와 GST-112를 RBIV와 혼합하여 실험한 군에서 바이러스를 넣지 않은 대조군 (negative control)과 유사한 결과를 얻었다. 반면에 RBIV (positive control)만을 접종한 well에서는 CPE가 관찰되었으며 중화반응의 결과들은 MTT assay를 통하여 분석하였다. 이러한 결과를 통하여 발현된 유전자들은 단백질 백신으로서의 가능성을 제시하였으며 또한 생성된 항체 중 RBIV-049L에 대한 항체로 RBIV를 신속진단할 수 있는 가능성을 보였다.