Molecular cloning and immunological characterization of annexin isolated from rockfish gill monogenean, Microcotyle sebastis

Abstract

In this study, we have cloned the full cDNA of an annexin gene from Microcotyle sebastis, for the first time in monogeneans, and preliminarily analyzed the possibility of the annexin (MsANX) as an antigen for the development of recombinant subunit vaccines against M. sebastis. The cDNA of MsANX comprises 1,238 bp with a 68 bp 5’ untranslated region, an open reading frame of 1062 bp, and a 108 bp 3’ untranslated region. The recombinant MsANX bound phosphatidylserine vesicles in the presence of Ca2+, whereas no MsANX was precipitated in the absence of free Ca2+, indicating that MsANX is a functional annexin. And the recombinant MsANX has anticoagulant acticity. In Western blot analysis, the sera of 2-year-old adult rock fish experienced heavy infection by M. sebastis specifically bound to the recombinant MsANX. However, sera collected from fingerlings that were not infected with M. sebastis did not bind to the MsANX. The specific humoral immune response against MsANX in rockfish, which were naturally infected with M. sebastis, suggests that MsANX has a possibility to be used as a subunit vaccine antigen. It remains to be investigated whether immunization of naive fish with the recombinant MsANX can induce protective immune responses against M. sebastis infection.

조피볼락 아가미흡충 (Microcotyle sebastis)에 대한 재조합백신개발을 위해 충의 cDNA library를 제작하여 항원 후보 유전자를 선정하였다. 제작된 cDNA library로부터 476개의 clone을 선별하여 염기서열울 분석하였고 NCBI의 BLAST X program을 사용하여 단백질에 대한 상동성 조사를 실시하였다. 분석된 유전자 중에서 annexin으로 추정된 유전자에 대하여, 5‘-과 3’- RACE를 실시하여 full-length cDNA를 얻었다. annexin의 방어항원으로서의 가능성을 분석하기 위해 full ORF annexin을 재조합 단백질로 발현, 정제하였으며 이 단백질로 annexin의 분자 면역 학적 특성을 알아보았다. 분석결과로부터 본 연구에서 제작한 재조합 annexin은 일반적인 annexin 단백질의 특성인 phospholipid vesicle에 결합하는 능력 및 anticoagulant acticity를 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 Western blot 결과 아가미흡충에 감염된 조피볼락의 혈청은 이 annexin과 binding 하는 반면 아가미흡충에 전혀 감염되지 않은 조피볼락의 혈청은 annexin에 대해 반응이 없는 것으로 보아 이번 연구에서 밝힌 아가미흡충의 annexin이 추후 아가미흡충증의 재조합 백신개발에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.