넙치 인지질가수분해효소 PLD 의 클로닝 및 특성분석

Abstract

Phospholipase D는 포유류 조직과 여러가지 cell lines을 포함하여 다양한 원핵생물과 진핵생물에 존재한다. 이러한 효소는 증식, 분비, 호흡폭발을 일으키는 수용체의 신호전달 과정에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 염증, 당뇨, 신경 및 심장자극과 같은 질병에서도 효소로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 우리는 넙치 PLD 유전자(PoPLD)를 클로닝 하였고, 서열을 확인하였다. PoPLD에 관한 연구는 넙치 뇌의 cDNA를 조사하는 것으로부터 시작되어졌고, 5’ 과 3’ RACE로 완성 되어졌다. PoPLD의 전체길이는 4656 bp로써, 5’ ― 194 bp와 3’-1300 bp의 UTR을 가지며, 시작 코돈 ATG부터 종결 코돈 TGA까지 3162 bp의 ORF를 가진다. 또한 PoPLD는 1053개의 아미노산을 가지며, 120.5 kDa의 크기로 확인되었다. 아미노산 서열 분석에서 hPLD1과 hPLD2는 PoPLD와 각각 65.30%, 49.38%의 상동성을 보였다. Phylogenetic tree와 서열분석을 통해, 다른 PLD와 비교한 결과, PoPLD는 PLD1 isozyme과 모든 구조적 특성을 공유하고 있었다. PoPLD의 조직 발현량 분석은 RT-PCR로 수행되었다. 이것은 뇌, 간, 심장, 두신, 체신, 장, 식도를 포함하는 모든 조직에 분포하였으며, 눈과 간, 위, 식도에서 높은 발현량을 나타냈다. PLD는 pEGFP-C1 벡터에 삽입되어 EPC에서 발현되어졌고, GFP-PoPLD를 형광현미경으로 관찰하였다. 이러한 결과들은 PoPLD가 PLD1의 isozyme이며, 다양한 조직에서 발현된다는 것을 보여주고 있다.

The gene encoding phospholipase D (PLD) in Olive flounder (Paralichthys olivaceus), designated PoPLD, was cloned and sequenced. PoPLD cDNA was obtained using a combination of cloning cDNA obtained from olive flounder brain, and the 3'- and 5'-rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The full-length PoPLD gene is 4656-bp long and contains an open reading frame of 3162 bp from the first ATG start codon through the TAA stop codon flanked by the 194 bp 5'- and 1300 bp 3'-noncoding regions. This gene was predicted to encode 1053 amino acids with a molecular mass of 120.5kDa. The deduced amino acid sequence shows 65.30% and 49.38% identity to Homo sapiens PLD1a (HsPLD1a) and Homo sapiens PLD2 (HsPLD2), respectively. The phylogenic analysis and amino acid sequence comparison suggest that PoPLD is closely related to the PLD1b isozyme. The tissue expression analysis of PoPLD showed that the mRNA of PoPLD was predominantly expressed in the eye, liver, stomach and duodenum. In addition, the recombinant protein of PoPLD (GFP-PoPLD), which demonstrated a phosphatidylcholine (PC)-hydrolyzing activity, was partiallylocalized as a distinct ring-shaped form surrounding the rim of the nucleus in EPC cells. Together, our results suggest that PoPLD is similar to mammalian PLD1b isoform and is generally widespread within olive flounder tissue.