Analysis of environmental stress inducible genes of abalone, Haliotis discus hannai using expressed sequence tags and cDNA microarray

Abstract

전복류는 전 세계적으로 100여종이 분포하며, 식용으로 기호성이 높기 때문에 생물학적 연구가 많이 이루어져 왔다. 그 중에서도 양식 환경에서 질병이나 스트레스에 대한 내성, 성장 등에 관심이 모아지고 있다. 해양생물의 생존 및 성장에 가장 큰 영향을 미치는 환경 요인으로는 수온과 염분을 들 수 있다. 해양생물 가운데 전복은 운동성이 제한되어 있어 수온이나 염분 농도의 변화는 대량 폐사를 유발할 수 있다. 최근 인간을 비롯한 많은 생물체에서 발현유전자 조각 (EST; expressed sequence tag)의 분석으로 유전자 발현양상에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나 EST 데이터 베이스의 대부분은 육상동물, 특히 포유류에 국한되어 있고, 전복을 비롯한 패류에 대한 EST자료는 극히 소수에 불과하다. 따라서 본 연구는 참전복, Haliotis discus hannai의 7 조직(아가미, 소화관, 간췌장, 표피, 근육, 정소, 난소)으로부터 EST를 확보하였으며, 환경 스트레스로 작용하는 수온과 염분 농도를 변화 시킨 후 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 그 후 microarray 방법을 통하여 환경 스트레스 노출 시 발현의 정도를 분석하고 특성을 연구하였다. 전복의 조직별 유전자 발현의 특성을 밝히기 위하여, 생물정보학을 이용하여 전복의 주요 조직으로부터 확보된 1,393개의 EST를 분석한 결과 cluster는 135개, singleton은 951개로 구성되어 있으며, 발현 중복율은 22%로 나타났다. 또한 BLASTX를 이용하여 유전자 검색 결과 1,278개 (91.7%)의 EST가 이미 알려진 유전자와 상동성을 가지는 것으로 나타났고, 나머지 115개 (8.3%)의 EST는 이제까지 알려지지 않은 유전자로 밝혀졌다. 전복의 주요 조직에서 밝혀진 발현 유전자 정보를 바탕으로, 전복의 수온과 염분 스트레스 시 전복에서 유도되는 유전자들을 탐색하기 위하여 고수온, 저수온, 저염분에 노출 시킨 후 suppression subtractive hybridization (SSH) 방법을 통하여 EST를 확보하였다. 총 1316개의 EST가 분석되었으며, 998개 (75.8%)의 EST가 이미 알려진 유전자와 상동성을 가지는 것으로 나타났고, 나머지 318개 (24.2%)의 EST는 알려지지 않은 유전자로 밝혀졌다. 밝혀진 유전자들을 분석한 결과 HSC, HSP family, major histocompatibility complex (MHC) class IIa chain, CD45, IRF7 등 다수의 클론들은 스트레스와 면역에 관련된 유전자와 상동성을 나타내었다. 전복의 환경변화 노출 시에 발현되는 스트레스 관련 유전자의 발현 차이를 조사하기 위하여 cDNA microarray 분석을 수행하였다. 우선 전복의 7개 조직으로부터 확보한 1,457개의 cDNA clone과 환경스트레스 노출에 의해 확보된 1,536개의 cDNA clone을 이용하여 3K cDNA microarray를 구축한 후, 수온 또는 염분 스트레스에 대한 발현 정도를 조사하였다. 그 결과 스트레스와 면역에 관련된 많은 인자들이 유의적인 차이를 보이고 있었으며, 기존에 알려진 유전자와 상동성을 지니지 않은 유전자들 가운데도 스트레스 조건에 따른 유의적인 차이를 보이는 유전자들이 조사되었다. 본 연구는 전복의 정상 조직의 발현유전자들의 특성을 조사하고, 환경 스트레스 노출 하에서 발현 차이를 EST 와 cDNA microarray 방법을 통하여 분석하였다. 분석된 결과들은 상대적으로 부족한 패류의 환경 스트레스 (수온, 염분)와 면역관련 유전자들에 대한 기초적 자료로 이용될 뿐만 아니라 유전자 발현양상의 특성을 조사함으로써 개체 및 조직 특이적 분석, 스트레스 특이적 유전자 표지 개발, 그리고 전체 cDNA 와 발현조절 부위 분리, 기능 분석에 응용 할 수 있다. 뿐만 아니라 스트레스 특이적 유전자와 유용 형질 유전자에 대한 탐색과 개발은 분자육종의 기초가 되는 유전자 지도 작성에 이용할 경우 신품종의 효율적 선발이나 유전자원의 평가와 같은 여러 분야에 활용이 가능하다. 따라서 본 연구 결과를 통해 전복의 환경스트레스 조건하에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 정보를 확보하고 특성을 연구함으로써 패류 유전체학의 유용한 정보로 이용될 뿐만 아니라 향후 내병성, 내환경성 전복의 품종 개발을 통해 전복 양식에 밑바탕이 될 것으로 기대 된다.

In chapter II, EST analysis was conducted using seven cDNA libraries made from gill, digestive gland, heptopancreas, skin, muscle, testis, and ovary. The assembly program ICAtools software was used to organize the redundant ESTs into overlapping contigs. The results showed that the 1,393 ESTs were composed of 135 clusters and 951 singletons, suggesting that the overall redundancy of the library was 22%. Of the 1,086 clones 1,278 clones (91.7%) were identified as known genes by BLAST searches and 115 clones (8.3%) did not match to any previously described genes. Based on major function of their encoded proteins, the identified clones are classified into 16 broad categories. Sequence analysis of ESTs revealed the presence of microsatellite-containing genes that may be valuable for further mapping studies. In chpater III, to analyze expressed genes for the temperature and salinity change, suppression subtractive hybridization (SSH) method was used and constructed three cDNA libraries from abalone exposed to heat-shock, cold-shock or hyposalinity stress. Putative function could be assigned to 75.8% of the 1,536 sequenced cDNAs. Based on sequence similarities, candidate genes was identified that may be implicated in stress response or immune function. Among them, several stress- and immune-related genes were identified including HSC, HSP, major histocompatibility complex (MHC) class IIa chain, CD45 homolog, and IRF7 from three subtracted cDNA libraries. The expressions of these genes were investigated in abalone exposed to stress. They were induced in response to stress, supporting their involvement in abalone immunity. In the chpater IV, to investigate the response of abalone to environmental stress by heat-shock, cold-shock or hyposalinity using a cDNA microarray consisting of over 2,993 different amplicons was done. Reverse transcription-RCR assays were used to verify the differential expression of candiate genes. The differentially expressed genes were previously revealed by suppression subtractive hybridization and EST surveys and were recognized to encode in components of the stress or immune system. Some of genes identified in this study were not previously recognized as a stress-associated genes. In addition, a number of genes with no known homologs were uncovered. Determination of their specific roles during stress condition may lead to a better understanding of stress response system. Overall, this series of experiments greatly expand our knowledge of the shellfish stress response and immune system at the DNA molecular level. In addition, the accumulation of a large number of identified cDNA clones is invaluable for abalone genetics and developmental biology. The cDNA clone tagging approach will rapidly build up the resource of the abalone genes and be feasible to clone most, if not all, of the abundantly expressed genes. Among the many possibilities and applications, these identified clones will be useful for selection of tissue-specific, cell type specific, stress-specific or disease-specific markers, isolation of full-length clones and gene promoters, and analysis of the gene expression pattern and gene function.