Molecular ecophysiological changes during the early development of the olive flounder, Paralichthys olivaceus exposed to cadmium and Aroclor 1254

Abstract

먼저 본 연구에서는 카드뮴이 어류의 초기생활사 단계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 넙치의 수정난 단계에서부터 부화자어시기까지를 5농도 구간 (5, 10, 20, 30 과 40 ㎍ L-1)에 노출시켰다. 그 결과, 수정난의 생존율과 부화율이 대조구에 비교하여, 30 ㎍ L-1 이상에서 카드뮴 농도에 의존하여 유의하게 감소하였다. 카드뮴 농도 20 ㎍ L-1 이상에서는 기형율이 유의하게 증가하였다. 이러한 기형 증상에는 수정난의 경우, 난황난 이상, 지느러미 진무름 (부식)과 척추 만곡이 있었다. 부화자어의 경우, 카드뮴 농도 20 ㎍ L-1 이상에서 생존율이 발달 이상을 동반하며 유의하게 감소하였다. 특히, 부화자어에서는 10 ㎍ L-1 이상에서부터 기형율의 유의한 증가를 보였으며, 이러한 기형증상에는 척추기형, 눈과 머리 부분의 비정상적인 발달 (소형)과 심각한 발달 지연이 관찰되었다. 또한, 본 연구에서는 Aroclor 1254가 어류의 초기생활사 단계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 카드뮴에서와 같은 방법으로 5 농도 구간 (1, 5, 10, 20과 40 ㎍ L-1)에 대해서 실험하였다. Aroclor 1254 역시, 수정난과 부화자어에서 각각 1과 5 ㎍ L-1 이상의 구간에서 유의한 생존율의 감소가 관찰되었다. 부화율은 10 ㎍ L-1 이상의 농도에서 유의하게 감소하였다. Aroclor 1254의 경우, 1 ㎍ L-1 수준의 낮은 농도에서도 발달 지연, 가벼운 출혈과 난황난의 부종이 관찰되었다. 수정난과 부화자어의 기형율 역시, 1 ㎍ L-1 이상의 농도에서 유의한 증가를 보였다. 이 때, 부화자어의 기형에는 출혈, 심장부위와 난황난의 이상, 두개골 이상과 부레 위축 등이 관찰되었다. 부가적으로, 본 실험에서는 제주, 여수 및 충남에서 공급받은 수정난을 대상으로 위와와 같은 실험을 실시한 결과, 위에서 관찰한 독성 인자에 대해 지역에 따른 유의한 차이가 관찰되지 않은 것으로 보아, 넙치의 경우 수서독성 시험방법 중 초기생활사 시험 방법의 공시생물로 적합할 것으로 사료된다. 두 번째로 유전독성은 수계환경에서의 종종 있는 야생 생물 군집의 감소 또는 멸종과 연관성이 있다. 이러한 유전독성을 유발하는 오염물질은 환경 중으로 배출되기 전에, 배출 가능 또는 적정농도가 확립되어 있을 필요성이 있으며, 때문에 인공 화학물질의 위해성 평가에서는 유전독성 영향을 확인할 수 있는 독성시험을 실시하는 것이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 넙치의 수정난과 부화자어를 대상으로 Cd와 Aroclor 1254에 의한 DNA 손상 여부를 알아보기 위하여 Random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석을 실시하였다. 이 실험 또한, 위에서와 같은 노출 디자인 (5, 10, 20, 30 and 40 ㎍ Cd L-1; 1, 5, 10, 20 and 40 ㎍ Aroclor 1254 L-1)이었으며, 노출시간은 부화자어 시기까지 총 72시간이었으며, 12시간마다 시료를 채취하였다. 대조구와 노출 구간의 RAPD profiles를 비교한 후, 도출된 데이터를 비교 분석하였다. 그 결과, Cd와 Aroclor 1254 두 물질 모두에서, 수정난과 부화자어의 DNA 손상의 증거가 관찰되었다. 또한, 이는 용량 의존적 반응을 보였다. 특히, 수정난의 RAPD profiles에서 대조구와 노출구를 비교하였을 때, 밴드가 새로 생기거나 사라진 수를 기준으로 하여 계산된 값 (the frequency value of mismatched bands)이 카드뮴은 20 ㎍ L-1 이상의 농도구간에서, Aroclor 1254는 10 ㎍ L-1 이상에서 유의하게 증가되었다. 즉, 수정난 발달기간 동안에는 위의 값 (the frequency value of mismatched bands)이 Cd와 Aroclor 1254의 농도에 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 그러나 부화 자어기 동안에는 이러한 용량의존적인 반응은 관찰되지 않았으나, 전 노출 구간의 값이 대조구에 비해 유의하게 높았다. 또한, 노출된 수정난의 RAPD profiles에서 얻어진 유전자 거리값은 대조구의 값보다 높았다. 이 결과를 바탕으로 MVSP 프로그램을 이용하여 유전자 클러스터링을 한 결과, Aroclor 1254의 농도가 높을수록, 노출 기간이 연장될수록 대조그룹과 분리되는 경향을 보였다. 그러나 카드뮴의 경우에는 농도에 따른 변화는 관찰되었으나, 노출 기간이 연장됨에 따른 클러스터링 변화는 관찰되지 않았다. 부화자어에서는 노출 기간에 따른 클러스터링 변화가 관찰되지 않았으나, Cd와 Aroclor 1254의 농도가 높을수록 대조구간과 분리되는 경향을 보였다. 세 번째로 카드뮴과 Aroclor 1254에 노출된 넙치 수정난, 부화자어와 자어에서의 Cyochrome P4501A1 (CYP1A1) 유전자의 차등발현을 조사하였다. 수정난과 부화자어의 실험 디자인은 위의 시험방법과 동일하게 시행하였다. 자어의 경우, Cd의 농도가 0.1, 1과 10 ㎎ L-1이었으며, Aroclor 1254는 0.5, 5와 50 ㎎ L-1로 설정하였고, 노출 기간은 1, 4와 10일이었다. 자어의 경우는 간을 시료로 하였고, 수정난과 부화자어는 여러 개체 (100미 이상)를 모아서 사용하였다. 이들 시료를 대상으로 semiquantitative RT-PCR과 Real-time PCR을 실시하여 CYP1A1의 차등 발현을 비교하였다. 넙치 자어 실험에서는, Cd 처리구간은 CYP1A1의 유의한 변화가 관찰되지 않았으나, Aroclor 1254의 경우 CYP1A1의 높은 유도를 보였다. 그러나 시간 및 용량에 따른 유도반응은 보이지 않았다. 수정난 단계에서는 CYP1A1이 발현을 관찰 할 수 없었으며, 부화자어의 경우는 Cd와 Aroclor 1254에 노출된 그룹 (두 물질 모두 10 ㎍ L-1이상의 농도)에서 용량에 의존적이지는 않았지만, 유의하게 증가된 CYP1A1 발현이 관찰되었다. 결론적으로 본 연구에서는 넙치 부화자어시기를 포함하여 Aroclor 1254가 유의하게 CYP1A1을 유도한 것을 확인하였다. 또한, 부화자어 시기에서의 CYP1A1의 발현은 수계환경에서의 오염물질의 노출에 대한 생물지표로서의 이용 가능성을 제시할 수 있다.