Evaluation of Optimal Condition for Mass Production of Ghost Bacterial Vaccine against Streptococcal Disease in Aquaculture

Abstract

Streptococcus iniae는 어류 연쇄구균증의 대표적인 원인균으로 구상의 그람양성균이며 캡슐에 쌓여있는 특성을 갖는 박테리아의 일종이다. 어류의 연쇄구균증은 전세계적으로 어류의 대량 폐사를 유발하여 막대한 경제적 손실을 초래하고 있어 S. iniae 에 대한 백신의 개발은 양식산업에서의 경제적 손실을 줄이기 위해 필수적이라 할 수 있다. 이전 연구를 통해 S. iniae의 항원 후보 단백질을 보유한 E. coli 고스트 박테리아 시스템이 구축되었으며, 이에 대한 항원 후보 단백질의 표면발현 및 고스트 발현 시스템의 작용여부를 플라스크 배양 상에서 모두 확인하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 5L 발효조를 이용하여 고스트 백신의 산업화를 위한 대량생산 조건 최적화에 관한 연구를 수행하였다. S. iniae의 4가지 항원 후보 단백질인 enolase, GAPDH, sagA 및 piaA를 각각 세포의 표면에 발현하도록 제작된 재조합 E. coli DH5α 균주들에 대해 탄소원 공급조건, 교반속도, 산소 공급 조건 등의 최적 배양조건을 검토하고, 고스트 발현 유도를 위한 온도조절 시점과 그에 따른 발현효율 등을 확인하였다. 각각 다른 4종의 항원 후보 유전자를 보유한 재조합 E. coli DH5α 고스트를 LB배지를 이용하여 배양한 결과 모두 1 g/L glucose, 300 rpm, 1 vvm에서 최대 균주 성장을 나타내었다. 고스트 생성 효율의 경우 초기 대수증식기(OD600=1.0)고스트 발현 유도를 개시하였을 때 각각 최대효율인 99.99%를 나타내었으나 균주 성장이 매우 저조하여 낮은 생산성을 보였다. 중기(OD600=2.0) 대수증식기에서의 고스트 발현 유도 결과 균주 성장이 개선되었을 뿐만 아니라 enolase 항원에서 99.92%, GAPDH항원에서 99.67 %의 우수한 발현효율을 나타내었다. 또한 고스트 생산성의 개선을 위한 방안으로 host를 E. coli XL-1 blue로 변경하여 새로운 고스트 백신 생산균주인 E. coli XL-1 blue/pHCE-InaN-GAPDH-Ghost37를 제작하였으며, 산업화를 위한 대량생산용 배지로서 Riesenberg 배지를 기본으로 하는 semi-defined medium의 사용을 위해 배지 조성을 최적화 하였다. 그 결과 Riesenberg 배지에 20 g/L의 glucose, 10 g/L의 yeast extract 및 250 mg/L의 thiamine을 첨가하여 사용하는 것을 최적조건으로 도출하였다. 최적화된 배지를 사용하여 fermentation parameter들을 조사한 결과 최대 균주성장이 5.5g/L에 이르는 등 현저한 증가가 나타나 고스트 생산성이 개선되었다. 이는 고스트 백신의 대량생산과 산업화에 있어 여전히 많은 가능성이 존재함을 보여주며, 최종적으로 E. coli를 이용한 고스트 백신이 양식산업에 있어 효과적이면서도 상업적으로 유용한 백신으로 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.

Streptococcal infections in fish result in septicemic diseases that have been reported worldwide causing severe economic losses in fish production. It is responsible for hemorrhagic septicemia in fish accompanied with meningoencephalitis and exophthalmia. Streptococcus iniae is among the major pathogens of streptococcal disease, in a large number of cultured fish species. S. iniae is a spherical Gram(+), encapsulated coccus. The development of a vaccine for S. iniae is essential to reduce economic losses in the aquaculture industry and to protect people involved in fish and fisheries activities. In previous studies, the producing system for E. coli ghosts containing S. iniae antigen candidates were constructed, and the analysis for surface expression of antigenic proteins and ghost cell generation were fully demonstrated with flask culture. Recombinant E. coli strains for ghost vaccine production was kindly provided by Dr. K. H. Kim, Pukyoung National University in Korea. Based on the previous results, the scale-up processes for industrialization of ghost bacterial vaccine with fermentation were evaluated. In this study, we are going to maximize ghost vaccine production from recombinant E. coli DH5αstrains which have 4 different antigens of S. iniae ― enolase, GAPDH, sagA and piaA by optimizing culture parameters such as glucose concentration, agitation speed, aeration, ghost efficiency, and temperature shifting point. The optimal batch fermentation parameters for all of the ghost strains were determined as 1 g/L glucose in LB broth, agitation with 300 rpm, 1 vvm aeration using 5 L jar fermenter. Ghost generation efficiency was varied with temperature shifting point - early exponential phase(OD600=1.0) shows the best result as 99.99 % with all of ghost vaccine candidates but productivities of ghost vaccines were lower than that of mid exponential induced vaccines. In case of mid exponential phase (OD600=2.0), highest ghost generation efficiency in the cultures were 99.92 % with enolase and 99.67 % with GAPDH. Furthermore, we constructed another ghost vaccine candidate - E. coli XL-1 blue/pHCE-InaN-GAPDH-Ghost37 and it tested for improving the ghost vaccine productivity on various parameters. The optimal medium composition was determined as 20 g/L glucose, 10 g/L of yeast extract, 250 mg/L of thiamine with Riesenberg's defined medium. After the fermentation parameters were optimized, the maximal cell growth were obtained about 5.5 g/L in 5L jar fermentation. And it shows that the more possibilities were still remained about ghost vaccine mass production and industrialization. Finally, we might expect that the bacterial ghosts with E. coli can be used as effective and commercially available vaccine in aquaculture.