High level expression of WSSV virion protein, VP466 by Escherichia coli for the development of vaccines against WSSV

Abstract

WSSV(White Spot Syndrome Virus)는 1992년 Taiwan에서 처음 발견 되었으며 봉입체의 타원형, double stranded DNA virus로 여러 갑각류에 감염된다. WSSV는 새우 백점병의 원인 바이러스로 새우 양식에서 높은 치사율을 일으켜 경제적으로 큰 손실을 입히고 있으나 이를 완벽하게 제어할 수 있는 방법이 아직 보고되어 있지 않은 실정이며, 따라서 본 연구에서는 WSSV envelop protein을 이용하여 WSSV를 제어하기 위한 유사백신 개발을 목표로 실험을 수행하였다. WSSV의 알려진 주요 단백질로는 VP19, 26, 28, 281, 466이 있으며, VP19와 28을 이용한 연구결과들은 많이 보고되어 있다. 본 실험에서는 VP466을 이용하였다. 감염된 새우로부터 WSSV를 분리한 후 단백질을 coding하는 DNA fragment VP466 gene을 정제된 바이러스로부터 PCR을 통해 증폭하였다. 이것을 pCold Ⅰ과 pHCE Ⅱ B vector에 삽입하였고 배양 시간, 온도, IPTG농도, E .coli host를 다르게 하여 test해 본 결과, pCold-VP466은 37℃에서 3시간, 0.5mM IPTG농도, host는 E .coli RIPL일 때 최적발현결과가 나왔으며 pHCE-VP466은 37℃에서 8시간, IPTG없이, host는 E .coli BL21(DE3)일 때 최적발현 조건으로 판단되었다. 이들 단백질들을 solubilization시키기 위해 urea buffer (8M urea, 50mM Tris, pH8.0)에서 sonication 하였고 투석으로 urea를 제거하였다. 단백질 농도는 Bradford-assay을 이용하여 평균 1.0mg/ml의 단백질 농도를 확인 할 수 있었으며 SDS-PAGE에서 band를 확인하였다. pCold-VP466경우는 His-tag이 있어 이를 affinity chromatography로 정제 하였고 anti-His antibody를 이용하여 western blot으로 확인 하였다. 재조합 단백질의 WSSV에 대한 면역효과를 검증하기 위하여 중화반응(neutralization assay)과 백신효과검정(vaccination test)을 수행 하였다. 각각의 crude protein (pHCE-VP466에서 발현시킨 단백질)과 purified protein (pCold-VP466에서 발현시킨 단백질)에 대한 항체를 생성시켜 ELISA로 확인하였다. 중화반응 실험에 사용된 새우는 평균 3g의 Crangon affinis(자주새우)와 Penaeus chinensis(대하)이며 실험에 사용하기 위한 바이러스 적정 농도를 구하기 위해 WSSV in vivo titration을 수행 하였다. 중화반응은 항체와 바이러스 반응액을 28℃에서 1시간 incubation 시킨 후 실험에 사용 하였으며 그 결과 positive control과 비교 하였을 때 VP466단백질로 생성된 항체에 의해 WSSV가 불활성화 됨을 알 수 있었다. Vaccination test에 사용된 새우는 5g의 Penaeus chinensis이며 in vivo titration 실험을 수행하여 vaccination에 적용할 적절한 농도의 바이러스와 VP466단백질 값을 구하였다. VP466 titration에서 높은 농도의 단백질을 주사하였을 때 바이러스에 감염 시키지 않았음에도 불구하고 새우가 영향을 받았으며 일주일이 지나도 100% 생존율을 보인 2㎍ crude protein 과 2㎍, 10㎍ purified protein을 vaccination 실험에 사용하였다. Injection에 대한 vaccination 실험에서는 바이러스 감염 후의 positive control이 4일 뒤 100% mortality를 보였고 10㎍ purified protein의 경우는 10일 지난 후에도 61% mortality로 positive control과 확연한 차이를 보였다. 이로써 VP466 protein이 백신으로써 효과가 있음을 확인 하였으나 Oral feeding에 의한 vaccination 실험에서는 80% 이상의 mortality를 보였으며 injection에 의한 vaccination 보다 현저히 낮은 면역 효과를 나타내었다. 이 결과들은 WSSV 유사 백신 개발에 응용 및 적용 될 수 있을 것이다.