Improvement of Vibrio anguillarum ghost bacteria vaccine and analysis of antigens for subunit vaccine

Abstract

양식 어류의 vibriosis는 우리나라를 비롯한 세계 각지의 양식 어류에 발생하는 주요 세균성 질병의 하나로 다양한 해산어, 담수어에 걸쳐 감염되는 것으로 보고되어 왔다. 어류의 Vibriosis를 예방하기 위한 백신에 대한 연구는 Vibrio anguillarum을 중심으로 이루어져 왔으며, 현재까지 주로 포르말린을 이용하여 세균을 불활화 시킨것을 항원으로 사용하고 있다. 이러한 포르말린 사균 백신은 백신 제작과정에서 표면항원성의 변형을 야기 시킬 수 있으며, 이로 인한 백신의 방어효율 저하를 초래하게 된다. 따라서 이러한 기존 사균 백신의 단점을 극복하기 위해서는 백신제작과정에서 표면 항원성을 변화시키지 않는 것이 필요하며, 이러한 방법의 일환으로 기존 연구에서 V. anguillarum ghost (VAG) 세균이 개발된 바있다. Ghost 세균은 Bacteriophage phiX174 E lysis gene의 발현을 통해 세균의 내막과 외막사이에 작은 pore를 만들고, 그 pore 사이로 세균의 내부 세포질을 배출시킴으로써 세균의 외부는 살아있는 세균과 똑같은 형태 및 항원성을 유지하지만 속은 비어있는 상태의 세균을 말한다. 그러나 기존의 연구에서 제작된 VAG는 최종 백신 산물내에 완전히 내부 세포질이 밖으로 빠져 나가지 못한 일부 세균들로 인해 plasmid DNA와 genomic DNA가 잔존하는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 VAG 백신의 어류 백신으로서의 안전성을 증진시키기 위해 최종 VAG 백신 산물내에 세균의 genomic DNA와 plasmid의 잔존을 없앨 수 있는 새로운 dual vector system을 개발하였다. 이 dual vector는 lysis E gene cassette와 세균내 핵산을 용해시키는 Staphylococcal nuclease A (SNA)를 포함하는 cassette로 구성되었으며, 각각은 온도에 의해 조절되는 lambda phage Pr-cI system에 의해 그 발현을 유도하였다. Conjugation 법을 이용하여 V. anguillarum을 새로 개발한 dual vector로 형질전환 한 후 ghost 세균 제작 효율 및 세균내 핵산의 잔존여부를 분석한 결과 기존의 VAG에 비해 ghost 효율이 증가되었으며, 또한 세균내에 핵산이 모두 분해되는 것을 확인할 수 있었다. VAG 백신과 FKC 백신의 면역유도능 차이를 분석하기 위해 틸라피아에 백신 실험을 한 후 각 실험구의 응집항체가를 분석한 결과에 있어서는 응집항체가 분석에 사용한 항원 type의 종류에 따라 상이한 결과가 나타났다. VAG로 면역화한 어류는 FKC로 면역화한 어류와 달리 V. anguillarum cadaver (VAC) 항원 type에 대해 유의적으로 높은 응집항체가를 보였으며 또한 boosting에 의해 항체가가 매우 높게 증가되는 현상을 보였다. 본 연구에서는 또한 단위백신의 개발 가능성을 분석하기 위해 V. anguillarum의 외막에 존재하는 epitope로, 독력과 운동성에 관련되어 있는 flagellin A (FlaA)와 담즙산과 생체막의 두께에 영향을 준다고 알려진 Outer mebrane protein U (OmpU)를 선택하여 이들의 재조합단백질을 제조한 후, 각각에 대한 토끼 항혈청을 제작하였다. 제작된 토끼 항혈청을 이용하여 V. anguillarum 및 V. harveyi등에 대한 bactericidal activity, ELISA 및 agglutination test를 실시한 결과 재조합 FlaA에 대한 토끼 항혈청이 유의적으로 높은 bactericidal activity, ELISA 및 agglutination titer를 나타내었다.

Vibriosis is the one of the main disease which occurs in cultured fish all over the world including Korea. It also has been reported that this disease is caused by an infection with bacteria to sea fish and freshwater fish. The study for vaccine to prevent infection of Vibriosis disease has mainly been developed through Vibrio anguillarum and it has been using inactivated bacteria by formalin vaccine as antigen until now. Such formalin-killed vaccine can cause a transformation of surface antigenicity while making vaccines, and it results in decrease of protective efficiency. Therefore, in order to get over a defect of the existing killed cell vaccine requires not to transform of surface antigenicity during the process of making vaccine. As a result, V. anguillarum ghost (VAG) bacteria was developed in the past study. Ghost bacteria refers to a bacteria that is empty inside but maintains antigenicity and same shape as the living bacteria with exhaust inner cellular through the pore after making a small pore between inner and outer membrane of bacteria through expressing Bacteriophage phiX174 E lysis gene. However, VAG produced in the past study showed that the plasmid DNA and genomic DNA still remains because of bacteria that couldn't completely get out of inner cytoplasm in a production of the final vaccine (VAG). Accordingly, this study is focused on the development of new dual vector system that can remove remain of plasmid and genomic DNA of bacteria in a production of the final vaccine to ensure safety of VAG vaccine. Dual vector is consisted of lysis E gene cassette and including Staphylococcal nuclease A (SNA) gene cassette that dissolves nucleic acid in bacteria, and it is in expressed according to lambda phage PR-cI system which is controlled by temperature regulatory. After transformation dual vector into V. anguillarum using a method of conjugation, the analysis showed that every nucleic acid in bacteria was dissolved and ghost efficiency has been improved compared to the previous VAG while analyzing the results of the production efficiency test of ghost bacteria and the existence of nucleic acid in ghost bacteria. After making an experiment on Tilapia with vaccine for analyzing differences of immune induction of VAG vaccine and FKC vaccine, result of analysis agglutination activity of each experiment Tilapia serum showed different outcome according to an antigen type (FKC or VAC type) used during the analysis. The fishes immunized against VAG was shown significantly higher agglutination activity to V. anguillarum cadaver (VAC) unlike the fishes immunized against FKC antigen type and antibody titer was highly increased by boosting. In this study, using epitope in outer membrane of V. anguillarum for analyzing development possibility of subunit vaccine manufactured recombinant protein selected Outer mebrane protein U (OmpU) known to influence a thickness of biofilm and bile salt, and flagellin A (FlaA) related to motility and virulence, after then produced to rabbit antiserum each. Using producted rabbit antiserum, as a result of testing bactericidal activity, ELISA and agglutination for V. anguillarum and V. harveyi it showed highly bactericidal activity, ELISA and agglutination titer in rabbit antiserum for recombination FlaA.