Overexpression, purification and characterization of lycopene cyclase from marine bacterium, Paracoccus haeundaensis

Abstract

카로티노이드는 세균, 조류, 곰팡이, 등에서 합성되는 노란색, 오렌지와 적색계통의 천연 색소로 자연계에 분포되어 있는 isoprenoid 계 subfamily이다. 카로티노이드는 식품 색소, 동물 사료 첨가제, 그리고 건강식품 보조제 및 화장품용으로 사용되고 있으며, 기능적으로는 비타민 A의 전구물질로 작용을 하며, 유해 활성 산소를 제거하는 항산화 활성과 만성 질병의 발병을 제어하는데 효과가 탁월한 것으로 주목 받고 있으며, 카로티노이드 중에서 lycopene은 각종 암, 피부노화, 고혈압, 천식, 당뇨 예방 및 심장기능 치료 하는데 효과가 있으며, 특히 암 유발과 노화에 관여하는 활성 산소를 제거하는 항산화제로 작용한다. 이러한 lycopene 보다 말단 부분을 고리화 되어 있는 β-carotene은 활성 산소를 제거하는데 효능이 더 띄어난 것으로 보고되고 있다. Lycopene cyclase는 lycopene의 말단 부분을 고리화하여 β-carotene으로 전환시켜 주는 반응을 촉매 하는 효소이다. 해양 미생물 Paracoccus haeundaensis로부터 유래된 crtY 유전자의 생화학적, 효소학적 특징을 구명하기 위해서는 대량의 순수 분리된 lycopene cyclase가 필요하다. lycopene cyclase 유전자는 386개의 아미노산을 암호화하는 1158 bp 개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 본 논문에서는 lycopene cyclase (CrtY) 유전자의 대량발현을 위하여 원핵세포 발현 벡터인 pET-44a (+) vector에 재조합 한 후, 대장균에 형질전환 시켰다. IPTG를 사용하여 대량 발현을 유도시킨 다음에, 발현시킨 lycopene cyclase를 친화적 크로마토그래피 방법을 사용하여 순수 분리 하였다. 정제된 단백질의 효소학적 특징을 기질인 lycopene과 반응 시킨 후에 HPLC와 spectrophotometer를 이용하여 분석하였다. 또한, lycopene cyclase의 cofactor인 NADH와 NADPH의 농도에 따른 Km과 Vmax 값 등을 구하였다.

Lycopene and β-carotene are one of approximately 600 known carotenoids. Lycopene cyclase converts lycopene to β-carotene by catalyzing the formation of two beta-rings at each end of the linear carotene. This reaction takes place as a two step reaction which both sides of the lycopene molecule are cyclized into β-carotene rings via the monocyclic γ-carotene as an intermediate. Lycopene cyclase gene (crtY) involved in the carotenoid biosynthetic pathway of Parcoccus haeundensis was subcloned into the expression vector, pET-44a(+), and expressed in E. coli BL21(DE) codon plus cell. The resulting protein expressed as a fusion protein containing an N-terminal six-histidine extension which derived from the expression vector. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography. Using the purified protein, the products of the enzymatic incubation mixture with a substrate lycopene were separated using HPLC and analyzed by spectroscopic method. Lycopene was converted into γ-carotene and β-carotene, resulting that the purified lycopene cyclase showed enzymatically active. Furthermore, substrate specificity and cofactor requirement of the purified protein were determined. The enzymatic reaction was stimulated by NADH or NADPH.