해산 양식어류에서 분리된 Vibrio harveyi의 신속 동정과 항원성에 대한 연구

Abstract

Vibriosis는 어류의 주요 질병이며, 그 중 V. harveyi는 새우류에서 많은 폐사를 일으키는 병원체로 알려져 있다. 최근 다양한 양식산 어류의 질병과 관련하여 그 분리빈도가 높아지고 있으며, 이들 어류에 대하여 대량폐사를 나타내기도 한다. 본 연구에서는 해산양식어류에서 병원성을 나타내는 비브리오속 균종 중 V. harveyi에 대산 백신연구의 기초자료를 얻기 위하여 신속하고 정확하게 동정하고, 분류하였으며, 분리된 V. harveyi 중 다양한 특성을 고려하여 대표균주를 정하고 항원성 등을 분석하고자하였다. 비브리오속 세균들은 그 분리와 동정에 있어서 생화학 성상이 유사하여 많은 혼돈을 일으키고 있으므로, 정확한 동정인자의 적용이 필요하다. 그러므로 먼저 V. harveyi 유사균주 22균주를 선정하여 생화학적인 특성을 규명하고자 하였다. API 20E kit를 이용한 생화학적 실험, 온도, pH 및 염분농도가 균의 성장에 미치는 영향 및 형태학적 특성실험을 수행하였다. 실험결과 V. harveyi 유사균주 11종을 선택하였으나 다른 비브리오종과의 확연한 차이는 나립ち?않았으므로 생리·생화학적 특성만으로는 V. harveyi의 정확하고 신속한 동정이 어려운 것으로 확인되었다. 그러므로 비브리오 균주간의 차이가 뚜렷한 RNA polymerase subunit B (rpoB) 유전자를 대상으로 VH-K1, VH-K2 primer를 제작하여 PCR에 의한 특이성을 확인하고자 하였다. 실험결과 비브리오속 내 15종의 비브리오 표준균주와의 비교하였으며, 분리균주들에 대한 적용도 가능한 것으로 확인되었다. 이 결과로 분리균주 중 11개의 균주를 V. harveyi라고 확정 동정 하였으며, 동정된 11개의 균주를 대상으로 균주간의 차이를 알아보기 위하여 RAPD-PCR과 haemolysin gene sequencing을 실시하였다. 그 결과 11개의 분리균주 모두 RAPD profile이 유사하게 나타났으며, haemolysin gene 부위도 98～100 %의 매우 높은 상동성을 나타났다. 분리균주 중 분리지역, 분리어종, 생리·생화학적 특성을 고려하여 3가지 균주(FP4138, E05003, C05011)을 선정하여 면역학적인 실험을 실시하였다. 선정된 3종의 분리균주에 대한 토끼 항혈청을 이용하여 실시한 슬라이드응집반응 실험을 하였을 때 동일균주들 간의 응집이 높게 나타났으며, 분리균주 중 C05011을 선정하여 백신의 효과를 측정해 본 결과 높은 방어 효과를 나타냈으며, 다른 균주에 대해서 교차방어 효과도 확인 할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 제작하여 사용한 VH-K1, VH-K2 primer를 이용한 PCR법을 통하여 V. harveyi를 보다 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 것으로 확인 되었으며, V. harveyi 균주들 사이에는 여러 type의 혈청형이 존재할 것으로 추정되며, 분리균주 중 하나인 C05011 균주에서 높은 백신효과를 증명할 수 있었다.

Vibrio harveyi, has been found in a diverse range of marine vertebrates and invertebrates and distributed to wide geographical area. This species are significant pathogenic agents and a cause of high mortality in marincultured fish and shrimp important in the aquaculture industry. For the rapid and specific detection of V. harveyi, a pair of specific primer VH-K1, VH-K2 was designed from nucleotide sequence of the RNA polymerase subunit B(rpoB) gene. V. harveyi isolates were appeared to be calssified into sevral serogroup tested by slide agglutination with antisera. Selected thues isolates of V. harveyi should different patterns in SDS-PAGE and western blot form that of luminosense V. harveyi kccm40866. One isolate C05011 induced antiserum in flounder, showing V. harveyi cross-reaction the other V. harveyi isolates.