Enhancement of disease resistance of olive flounder(Paralichthys olivaceus) using systems producing CpG DNA and double-stranded RNA

Abstract

Unmethylated CpG motifs in DNA and double-stranded RNA (dsRNA) are recognized as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by toll like receptor 9 (TLR9) and TLR3, respectively, which trigger strong proinflammatory responses in vertebrates. In the present study, effects of CpG DNA and dsRNA on disease resistance of olive flounder were investigated, and various forms of CpG DNA and dsRNA were developed for practical use of them in aquaculture. Firstly, we found that CpG-ODNs belonging to different classes have different abilities to increase resistance of olive flounder against different pathogens, in which fish administered CpG-ODN 2216 (A-class) showed the highest resistance against VHSV infection and the strongest expression of Mx and ISG15 genes, whereas fish administered CpG-ODN 1668 (B-class) induced the strongest scuticocidal activity of serum and the highest survival rate against Miamiensis avidus infection. Secondly, we have firstly demonstrated that plasmids harboring multiple copies of CpG 1668 motifs enhanced resistance of olive flounder against M. avidus infection. The use of plasmids containing multiple CpG motifs instead of artificially synthesized CpG-ODNs would be a way to low the cost. And, we constructed plasmids that harbor multi-copy of CpG motifs that belonging to different classes, and verified that administration of the constructed plasmids enhanced disease resistance of olive flounder against both VHSV and M. avidus infections. Furthermore, delivery of plasmids harboring CpG motifs by auxotrophic Escherichia coli mutant also enhanced disease resistance of olive flounder. Thirdly, we have newly cloned TLR3 cDNA of olive flounder, and analyzed in vivo expression of the TLT3/TLR22 in response to poly (I:C). Furthemore, using short-hairpin RNAs (shRNA) targeting TLR3 and TLR22 in HINAE cells, we revealed the critical role of TLR22 in induction of type I interferon response. Fourthly, we demonstrated that olive flounder leucocytes stimulated with poly (I:C) showed increased scuticocidal activity in the presence of inactivated immune serum, and in vivo administration of poly (I:C) increased survival rates of olive flounder agasinst M. avidus infection. Furthermore, dsRNA containing CpG motifs sequences induced higher resistance in olive flounder against M. avidus and VHSV infections when compared to dsRNA without CpG motif sequences. Conclusionly, the present resutls indicate that plasmids and dsRNAs harboring CpG motifs can be used as effective immunostimulants that can simultaneously enhance resistance against viral and parasitic diseases.

CpG motif DNA 및 double-stranded RNA 생성 system을 이용한 넙치의 질병 저항성 증강

강 예 재

부경대학교 대학원 수산생명의학과

unmethylated CpG motif와 double-stranded RNA (dsRNA)는 척추동물에서 Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)로 인식되며, 각각 TLR9과 TLR3에 의해 인식된 후 여러 신호전달단계를 거쳐 다양한 면역반응을 자극한다. 본 연구에서는 dsRNA와 3가지 type의 CpG DNA를 넙치에 면역자극제로 사용하여 기생충성질병인 Miamiensis avidus와 바이러스성 질병인 VHSV에 대한 방어력에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 CpG motif를 지닌 dsRNA를 제작하여 넙치에서 실질적으로 질병 방어에 영향을 주는지 알아보았다.

1. 3가지 class CpG-ODN의 면역자극과 질병에 대한 방어효과 CpG-ODN 2216 (A-class)을 주사한 넙치는 Mx 와 ISG15유전자의 강한 발현과 VHSV감염에 대한 높은 생존율을 보여준 반면, CpG-ODN 1668 (B-class)을 주사한 어류는 M. avidus 감염에 대한 높은 생존율과 증가된 serum scuticocidal activity를 보여주었다. 또한 CpG-ODN 2395 (C-class)는 VHSV와 M. avidus 감염에 중간정도의 효과를 나타내었다. 이로부터 각각의 class에 속하는 CpG-ODNs은 서로 다른 병원체에 대한 방어능력을 나타냄을 알 수 있었다.

2. CpG 1668 motif를 여러 개 가진 plasmid와 CpG motif 3개의 class가 mix된 plasmid를 통한 VHSV 및 M. avidus에 대한 방어효과 와 이를 delivery 할수 있는 mutant E. coli를 이용한 M. avidus에 대한 방어효과 분석 CpG 1668 motifs를 15개, 30개 및 60개를 가진 plasmid를 제작하여 이들을 넙치에 투여한 후 M. avidus감염에 대한 저항성을 분석한 결과 60개의 motif를 지닌 plasmid가 가장 높은 serum scuticocidal activity 및 높은 생존율을 유도하였다. 이로부터 비교적 제작비용이 고가인 인공 합성 CpG-ODNs 대신에 경제적으로 합성이 가능한 multiple CpG motifs를 탑재한 plasmid를 사용하여도 같은 면역증진 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다. 또 3종류의 class에 속하는 CpG motif를 탑재한 plasmid를 제조하여 넙치에 투여한 결과 VHSV와 M.avidus 질병 둘다의 감염에 대해 증가된 방어력을 보여 주었으며, 또한 높은 serum scuticocidal activity와 Mx, ISG15유전자의 높은 발현을 보여주었다. Delivery system으로 CpG motif가 탑재된 plasmid를 auxotrophic Escherichia coli mutant에 transformation하여 넙치에 투여한 결과 M. avidus에 대한 방어력이 증진됨을 알 수 있었다.

3. 넙치 TLR3 cloning 및 in vivo와 in vitro에서 TLR3/ TLR22의 역할 분석 넙치 TLR3 cDNA를 cloning하였으며, poly (I:C) 자극에 의한 넙치의 TLR3/TLR22의 발현을 분석하였다. 또한 shRNA를 이용해 HINAE cell에서의 TLR3혹은 TLR22의 발현을 저해하는 실험을 통해 TLR22가 외부에서 투여된 dsRNA에 의한 type I interferon 반응유도에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

4. CpG motif를 지닌 dsRNA의 질병 방어능 증진 효과 CpG motif를 지닌 dsRNA가 CpG motif가 없는 dsRNA에 비해 M. avidus 와 VHSV 모두에 대해 높은 저항성을 유도함을 넙치 실험을 통해 알 수 있었으며, 또한 CpG motif를 지닌 dsRNA는 Mx와 ISG15유전자의 강한 발현유도 및 serum scuticocidal activity도 증진됨을 보여주었다.