강도다리, Platichthys stellatus Pallas 연쇄구균증의 병원균 특성과 백신에 관한 연구

Abstract

강도다리는 현재 새롭게 양식이 시도되고 있는 품종으로 건강한 양식생물을 생산할 수 있는 적정 환경과 병원체에 대한 감염 및 양식생물의 방어능력에 대한 연구는 전무한 실정이며, 넙치에 비해 질병에 대한 피해가 적은 것으로 알려져 있다. 하지만, 강도다리를 경북 동해안 지역의 지역 특화 품종으로의 개발을 위한 초기인 2007년 8월말부터 12월 중순까지 넙치 육상 수조식 양식장의 강도다리 양식 수조에서 넙치의 연쇄구균증상과 유사한 증상으로 대량 폐사가 발생하였다. 따라서 본 연구에서는 2007년부터 2011년까지 강도다리에 발생한 연쇄구균증의 원인 병원체를 분리 동정하고, 이 병원체의 유전형적 및 병원성 특성을 구명하여 연쇄구균병에 대한 강도다리와 넙치의 연관성을 조사하였다. 그리고, 강도다리 연쇄구균증의 병원균에 대한 백신을 복강 주사하여 그 효과를 알아봄으로써 강도다리 양식의 질병 예방 기술 개발에 기여하고자 하였다.

1. 강도다리 연쇄구균증의 원인균 분리․동정 연구

강도다리, Platichthys stellatus 양식장에서 안구돌출 및 출혈, 복수에 의한 복부팽만 등의 특징적인 증상을 보이면서 53.9%의 누적 폐사량을 유발하는 질병은 연쇄구균증이다. 이 질병에 감염된 강도다리의 간, 신장, 비장 조직은 다양한 정도의 괴사 와 염증성 세포의 침윤 현상이 나타난다. 특히 심외막의 염증성 병변과 세균을 탐식한 백혈구계 침윤 세포가 심근에서 관찰되는 감염 특성이 관찰되었다. 전형적인 연쇄구균증상을 보이는 강도다리의 내부 장기로부터 γ-용혈능, catalase와 oxidase 음성, 그람 양성을 나타내는 연쇄상 구균을 최초 분리하였다. 분리된 원인균은 Streptococcus parauberis로 동정된 KCTC3651, FP2284균주와 일부 당 이용능을 제외한 생화학적 성상에서 유사한 결과를 보였으며, 10℃, 20℃, 37℃에서 발육, 45℃에서는 자라지 않는 특성을 보여, 강도다리와 넙치의 연쇄구균 감염이 저수온에서 고수온에 이르기 까지 질병 발생 가능성이 있음을 확인하였다. 강도다리에서 분리된 연쇄구균증의 원인균이 S. parauberis임을 확인하기 위해 Multiplex PCR을 이용한 분자생물학적 검사 결과, 강도다리에서 분리된 PH0710, PH0711, PH1012, PH1108 및 UJ1106 균주는 넙치에서 분리된 균주인 FP2284 및 참조균주인 KCTC3651과 동일한 718 bp 크기의 증폭산물이 생성됨으로써 강도다리 연쇄구균증의 원인균이 S. parauberis로 최종 동정하였다.

2. 강도다리 연쇄구균증의 병원균 특성 연구

그람 양성 세균 종 분류에 유용하게 사용되는 3가지 house-keeping 유전자를 분석하여 우리 나라 강도다리 및 넙치에서 분리되는 S. parauberis의 유전적 분류를 시도하였다. 16S rRNA 와 groEL 유전자의 경우 시험한 모든 균주에서 동일한 유전형을 나타내어, S. parauberis 균종사이에 16S rRNA 및 groEL 유전자의 다양성은 없었으나, gyrB 유전자에 있어서는 17균주 중 9균주의 경우 특정 부위에 염기배열이 바뀐 point mutation(quinolone resistance-determining regions)이 확인되었다. 16S rRNA, groEL, gyrB 유전자 특성으로는 강도다리 및 넙치 분리 균주들은 그 숙주 별로 유전적인 차이를 확인 할 수 없었으며, 분류학적으로는 거의 동일한 유전형을 가지는 것으로 생각된다. 강도다리와 넙치의 병원성 비교 시험에서는 혈청 내에 살균 작용에 대한 S. parauberis의 생존능을 평가한 결과 그 분리된 숙주 유래에 관계없이 시험한 모든 균주는 넙치 혈청보다 강도다리 혈청에서 더 높게 생존하였다. 넙치 혈청에서는 균수가 점차적으로 증가 또는 정체하는 현상이 관찰되는 반면, 강도다리 혈청에서는 S. parauberis 균이 성장할 뿐만 아니라 기하급수적으로 증가하는 양상을 나타내었다. 또한, 농도별 인위 감염시험에서도 강도다리의 누적폐사율이 현격히 높은 결과로 볼 때, S. parauberis 균에 대한 감수성에 있어 넙치보다 강도다리가 높은 병원성 특성을 가졌다. 이러한 결과는 S. parauberis 균에 대한 강도다리의 반수치사농도가 102～103.66인 반면 넙치는 108 이상인 것으로 입증되었다.

3. 강도다리 연쇄구균증 백신 연구

양식 강도다리에 대한 γ-용혈성 S. parauberis PH0710균주에 대한 백신 농도 및 종류별 효과 시험을 in vivo에서 실시하였고, 그 결과에 따라 양식현장에서 백신의 효과 시험을 조사한 결과 in vivo 시험에서의 백신은 formalin-killed cells, heat-killed cells, extracellular producters를 제작하여 농도별 단독 또는 복합으로, 강도다리 복강에 주사하여 백신 효과를 검증한 결과 항체가 및 방어력에서 formalin-killed cells 1 ㎎/fish 농도가 적합한 것으로 나타났다. 양식 현장에서 self-refilling syringe (SOCOREX, SWISS)를 이용하여 강도다리 복강에 1 ㎎/fish농도로 1회 접종한 결과 8주째에 항체가가 증가하였으며, 공격 시험에 따른 RPS는 80～83.3을 나타내어 높은 방어력을 확인하였다.

Starry flounder, Platichthys stellatus is one of fish species newly trying to commercial aquaculture in Korea, little has been known about immune systems and diseases of this species. Mass mortalities c.a. 54% with clinical signs of exophthalmia, abdominal distention, haemorrhaged on body surface, occurred in cultured starry flounder farms in Gyeongsangbuk-do in 2007. In this study, describes the characteristics of streptococcal infection agents isolated from diseased starry flounder, from 2007 to 2011, in South Korea and also was to compare the phenotypical, genetic, pathogenic ability of S. parauberis isolated from olive founder. For prevention of this disease, vaccine efficacy was also estimated of S. parauberis for starry flounder by using killed cells and bacterial ECPs.

1. Studies on Isolation and Identification of streptococcal infection agents from starry flounder A disease with mass mortality characterized exophthalmia and abdominal distension by ascites occurred in farmed starry flounder, Platichthys stellatus in Pohang since September of 2007. Severe necrosis and infiltration of inflammatory cells were observed in tissue histopathological sections from liver, kidney, spleen and heart of the diseased fish. The catalase-negative and gram positive cocci with γ-hemolysis were isolated from streptococcicosis starry flounder, Platichthys stellatus. We isolated 5 strains of the genus Streptococcus from the diseased starry flounder. Analysis of the microbiological characteristics and the multiplex PCR of the isolates showed that strains were identified as Streptococcus parauberis.

2. Studies on characteristics of streptococcal infection agents from starry flounder All S. parauberis isolates were showed γ-Hemolysis on starry flounder, olive flounder and sleep RBC containing agar plates. The 16S rRNA, groEL and gyrB gene sequences of all strains, which are identical, showed 100% identity with those of S. parauberis. However, the gyrB gene sequences were classified as two genogroups, which sequences were contained point mutation. Interestingly, all S. parauberis strains were able to exhibit resistance against starry flounder, but the cells numbers of all tested strains declined by in olive flounder. The S. parauberis isolates were strongly pathogenic to starry flounder showing LD50 values for i.p. injection of 5.0 × 102 ∼ 5.0 × 103.66 CFU/fish. Most dead fish were observed "pop eye", exophthalmons, and in the internal organs of haemorrhages and congestion on liver, enlarged spleen and kidney.

3. Studies on Vaccine of streptococcicosis for starry flounder Vaccine efficacy by using S. parauberis PH0710 were estimated by antibody titers, challenge test in vivo, which evaluated by antigens doses and type of antigens. According to in vivo tests, formalin-killed cells, heat-killed cells, extracellular producters were selected, apply to starry fish. The antibody titers of FKCs immunized groups were significantly higher than those of ECPs, HKCs immunized groups. According to antigen dosage, antibody titers of formalin-killed cells (FKC) 1.0 ㎎/fish and FKCs 0.1 ㎎/fish injected groups were significantly increased. Antibody titers of FKCs 1.0 ㎎/fish vaccinated groups were reached maximum at 4 weeks after injection. Although the different levels of antibody production were showed by the vaccinated fish, the good protection obtained in challenge trials of the FKCs 1.0 ㎎/fish vaccine group. Relative percent survival (RPS) of the fish immunized with FKCs 0.1 ㎎/fish group and FKCs 1.0 ㎎/fish group were 100% and 100%. respectively. Vaccine efficacy by using S. parauberis PH0710 were estimated by antibody titers, challenge test in aquafarm. Antibody titers of FKCs 1.0 ㎎/fish vaccinated groups were reached maximum at 8 weeks after injection. Relative percent survival (RPS) of the fish immunized with FKCs 1.0 ㎎/fish group were 80 and 83.3%.