영양요구성 재조합 돌연변이 Edwardsiella tarda 제작 및 생물모니터로서의 이용가능성 평가

Abstract

재조합 세균을 이용한 생물지표 혹은 생물모니터 연구는 주로 대장균을 대상으로 연구가 되어 왔으며, 해수 세균을 대상으로 한 연구는 거의 이루어져 있지 않다. 본 연구에서는 해양에 상재하면서 동시에 어류에 병원체로 작용하는 세균인 E.tarda를 대상으로 형광발현 재조합 세균을 제작 후 생물모니터로서의 활용기능성을 분석하였다. 먼저 재조합 E. tarda의 제작은 allelic exchange를 이용하여 chromosome DNA에서 alanine racemase gene (alr)을 knock-out 시키고 그 자리에 항시고발현 promoter에 의해 발현되는 green fluorescent protein (GFP) 유전자 cassette를 삽입함으로써 배지에 D-alanine의 공급없이는 자랄 수 없으면서 동시에 GFP를 그 세포질에 발현하는 영양요구성 돌연변이 E. tarda를 제작하였다. 그러나 이 GFP를 발현하는 재조합 E. tarda를 이용하여 생물모니터로서의 활용가능성을 분석한 결과 GFP 유전자가 chromosome에 1 copy로만 존재하기 때문에 특정 물질의 농도에 따른 독성 변화를 모니터링 하기에는 reporter 단백질인 GFP의 발현량이 너무 적었고, 그로 인해 민감도가 떨어지는 단점이 있었다. 이러한 단점을 보완하기 위해 2차 실험에서는 형광단백질을 GFP가 아닌 Red fluorescent protein (RFP)로 바꾸었으며, RFP 발현 cassette의 copy 수 문제를 해결하기 위해 그 발현 cassette를 plasmid에 삽입하였다. 또한 E. tarda의 chromosome상에 있는 aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd) 유전자를 knock-out 시키고, asd 유전자 발현 cassette를 RFP 발현 plasmid에 함께 삽입하여 이를 asd가 knock-out된 E. tarda에 transformation 함으로써 항생제 내성유전자의 사용없이도 RFP 발현 plasmids를 유지할 수 있는 재조합 E. tarda 시스템을 구축하였다. 이렇게 구축된 재조합 E. tarda를 이용해 ampicillin 및 ZnCl2 농도별 RFP 발현량을 측정한 결과 농도에 따른 RFP의 발현량이 차이가 있게 나타남으로써 생물모니터로서의 활용이 가능함을 알 수 있었으며, 또한 해수 염분농도를 포함한 다양한 염분농도하에서도 같은 결과가 나타남으로써 해수용 바이오모니터로서의 활용가능성이 있음을 알 수 있었다.

In the present study, we have generated recombinant auxotrophic Edwardsiella tarda mutants expressing green or red fluorescent protein (GFP or RFP), and evaluated their possible availability as a biomonitor. At first recombinant auxotrophic E. tarda mutant expressing GFP was rescued by the allelic exchange method, in which the chromosomal alanine racemase gene (alr) that plays essential roles in bacterial cell wall biosynthesis was replaced with an expression cassette harboring a high constitutive promoter (EtPR)-driven GFP gene. However, this E. tarda mutant was not sensitive to monitor concentration-dependent toxicity of certain molecules, because of the presence of only one copy of the GFP gene, which might lead to the decrease of sensitivity. Furthermore, to maintain the alr knock-out E. tarda mutant, D-alanine should be supplemented in the growth medium. To complement these shortcomings, we have conducted additional experiments in that the chromosome-based GFP expression system was replaced with plasmid-based RFP expression system, and newly generated the aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd) knock-out auxotrophic E. tarda mutant. Additionally, a newly constructed asd expression cassette was inserted into the RFP expressing plasmids, which allow the plasmids can be maintained in the asd knock-out E. tarda without use of antibiotic-resistant genes and the mutant E. tarda can grow without supplementation of a certain nutrient. By using this recombinant E. tarda system, we observed different levels of RFP expression in response to different concentrations of ampicillin or ZnSO4 in an extensive salinity environment, suggesting that the present asd knock-out E. tarda expressing RFP might has a potential to be used as a marine biomonitor.