Clownfish류의 인공번식과 대량생산을 위한 발생생리학적 연구

Abstract

요 약 1. 산란주기와 번식행동 Amphiprion melanopus 어미 네 쌍(A, B, C 및 D)을 수온, 염분 및 광주기가 일정하게 유지되는 환경에서 1,675일 동안 사육하였다. 사육일 동안 총 산란횟수는 최소 38회에서 최대 127회, 연간 산란횟수는 최소 12.6회에서 25.4회였으며, 월간 산란횟수는 1.4회에서 2.3회였다. 월간 최대·최소 산란횟수는 각각 4회, 0회였다. 4쌍 모두 특정 휴지기를 제외하고 연중산란을 하였다. A와 B는 각각 6개월, 5개월의 휴지기가 있었던 반면, C와 D는 각각 6개월, 8개월의 휴지기가 있었으며 간헐적으로 나타났다. 월령이 차단되고 수온, 염분, 및 광중기가 일정한 환경에서 A. melanopous의 산란은 개체의 연주리듬을 따르는 것으로 보인다. A. melanopous의 산란행동은 4단계로 구분된다. 1) 부화판과 주위 청소, 2) 암컷의 산란관으로 부터의 점액질 점착, 3) 산란 및 수정, 4) 수컷에 의한 수정란 관리. Clownfish류는 산란전에 항문에서 산란관이 돌출된다. 본 실험에서는 산란 전에 암컷이 자신의 산란관에서 점액질을 부화판에 점착시키는 모습이 10∼15분 동안 관찰되었다. 암수의 산란 및 수정은 50∼60분이 소요되었다. 수컷은 egg-fanning을 하여 수정란 관리하였으며, 부화일이 가까워질수록 그 횟수가 증가하는 경향을 보였다.

2. 난발생, 자치어발달 수정란은 타원형의 침성부착란으로 불투명한 색이었으며, 장경 2.37±0.09 mm, 단경 0.94±0.91 mm였다. 난황에는 다양한 크기의 많은 유구가 보였다. 상실기는 수정 후 9시간째에 일어났으며, 19.3시간에는 배반엽이 난황의 절반을 덮었다. 46시간이 지나고 나서 머리에서 안포와 이포가 형성되었고 수정 후 57.0시간째에는 꼬리가 난황과 분리되었고, 근절은 24～25개가 되었다. 70.0시간이 경과하고 나서 심장형성과 함께 심장박동이 관찰되었으며 분당 심장 박동수는 160.0회였다. 부화까지 180시간 소요되었고 부화율은 89.5%였다. 소등 후 1.5시간에서 2시간 사이에 부화하였다. 갓 부화한 자어(3.5±0.3 mm)는 대부분 난황을 흡수한 상태였고 몸은 투명했다. 부화 후 5일째 자어는 체색이 검게 변해있었고, 9일째 머리 윗부분과 등지느러미부근에서 흰색 줄무늬기 나타나기 시작했다. 부화 후 15∼20일째 자어의 체색은 검게 변했으며, 머리와 몸 중간 부위의 흰 줄무늬도 선명했다. 25일째가 지나면서 꼬리지느러미에도 흰 줄무늬가 나타가기 시작했고, 부화 후 30일째 자어의 입 주변과 각 지느러미는 주황색으로 선명했으며, 등지느러미와 꼬리지느러미의 흰 줄무늬는 사라지기 시작했다. 부화 후 60일째 자어의 몸 전체의 색깔은 진한 고동색에서 적갈색으로 변해 있었다. 90일 째 자어의 3개 흰 줄무늬 중 머리 줄무늬만이 남아 있었다. 갓 부화한 자어를 20일 동안 세 가지 형태의 먹이를 공급하고 생존율을 조사한 결과, rotifer, Artemia nauplii 그리고 영양강화 Artemia를 공급한 실험구의 생존율이 78.3%로 가장 높았다. 그러나 rotifer만 공급한 실험구는 실험종료 전에 전량 폐사하였는데, 부화 후 9∼10일 사이에 가장 많은 폐사개체가 발생하였다. 이 시기는 9일째 흰 줄무늬가 발생되는 시점과 같다는 점에서 보면, 체색발달과 함께 변태과정에 필요한 충분한 에너지원이 공급되어야 한다는 것을 시사한다.

3. 인공 부화장치 개발 Clownfish 수정란의 효율적인 부화를 위하여 에어레이션형, 스프레이형, 회전 수류형 부화장치를 이용하여 A. melanopus, A. ocellaris, A. polymnus 그리고 Premnas biaculeatus의 부화율을 조사하였다. 그 결과, 4어종 모두 회전 수류형에서의 부화율이 85%이상으로 가장 높았다. 에어레이션형과 스프레이형은 각각 60.5%, 74.4%였다. 부화율이 가장 높았던 회전 수류형을 대상으로 부화판의 개수를 2, 3, 5개를 각 부화장치에 넣어 부화율을 조사한 결과, 각각 87.3%, 81.8%, 82.0%로 2개의 부화판을 넣었을 경우, 비교적 높은 부화율을 나타내었다. 그러나 부화판을 2개 이상 넣더라도 부화율이 80%이상이었으므로 실제 생산량으로 보았을 때 5개의 부화판이 더 많은 양의 수정란을 부화시킬 수 있을 것으로 예상된다.

4. 체색변태에 미치는 먹이종류와 갑상선호르몬(T3)의 영향 먹이생물에 따른 실험은 부화 후 10일째 자어를 대상으로 EA(only enriched Artemia)구, ATenriched Artemia + Tigriopus japonicus), TJ( only T. japonicus)으로 구분하여 7일간 실시하였다. 갑상선호르몬 실험의 경우, 부화 후 7일째 자어를 0, 2, 4 및 6 ppm의 농도로 1시간 동안 침지하여 10일간 사육하였다. 그리고 체색 농도에 대한 분석은 photoshop (Adobe, USA)의 CMYK 분석법을 이용하였다. 체색분석 부위는 입주변, 머리의 흰 줄무늬, 몸 중앙, 등지느러미 그리고 꼬리지느러미였다. 먹이생물에 따른 성장결과에서 AT구는 11.3±0.7 mm으로 가장 빠른 성장을 보였지만, 10.9±0.8 mm인 TJ구와 유의한 차이가 없었다. EA구는 10.2±0.8 mm였다. CMYK분석 결과, TJ구의 입 주변과 등지느러미는 각각 81.8±3.5%, 75.8±6.7%로 가장 높은 magenta 수치를 보였다. 등지느러미에서도 TJ구가 94.8±4.3%로 가장 높은 yellow 수치를 나타냈다. 갑상선호르몬 처리에 따른 성장은 4 ppm구가 11.4±0.4 mm로 가장 빠른 성장을 보였던 반면 6 ppm구는 10.2±0.5 mm로 가장 느린 성장을 보였다. 등지느러미의 CMYK 분석 결과, 2 ppm구와 4 ppm구의 yellow 수치는 각각 92.8±3.5%, 93.8±4.0%였고, magenta 수치는 67.4±5.3%, 56.0±8.4%로 대조구보다 높은 경향을 보였다. 꼬리지느러미의 경우, 4 ppm구에서 magenta와 yellow 수치가 각각 73.6±3.6%, 99.8±0.2%로 다른 실험구에 비해 가장 높았지만 2 ppm구와 유의차가 없었다. 본 실험을 통해 먹이생물인 T. japonicus와 호르몬인 T3를 이용하여 성장과 체색 향상을 확인할 수 있었다. 그리고 자치어와 같은 작은 개체의 체색 분석을 위해 photoshop의 CMYK 분석방법은 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

5. Prolactin, arginine vasotocin 및 isotocin 유전자 클로닝 및 저염분 환경에 의한 유전자 발현 A. melanopus의 pro-PRL, prepro-AVT, prepro-IT cDNA의 구조를 밝혔다. PRL 전구체는 212개의 아미노산으로 이루어져 있었고 그 중 24개의 아미노산은 신호 펩타이드, 188개의 아미노산은 mature 단백질로 되어 있었다. AVT full cDNA는 총 153개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, 신호펩타이드는 19개, mature AVT는 9개, Neurophysin은 125개의 아미노산으로 이루어져 있었다. IT는 총 156개의 아미노산으로 이루어져 있었고, 19개의 신호펩타이드, 9개의 IT, 128개의 Neurophysin으로 이루어져 있었다. A. melanopus를 15 psu로 염분을 감소시킨 후, 0, 4, 8, 24, 48h 그리고 144h에 뇌와 뇌하수체를 분리하여 세 유전자의 발현을 조사한 결과, PRL은 24h구에서 가장 높은 발현을 보였다. 48h과 144구는 다소 감소하는 경향을 보였다. AVT와 IT 모두 48h구와 144h구에서 대조구에 비해 발현도가 증가하는 경향을 보였다.

6. 저염분 사육에 따른 생리·생화학적 조사 A. melanopus를 15 psu로 염분을 감소시킨 후 아가미를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 해수의 아가미 표면은 매우 고르지 않았지만, 15 psu의 아가미표면은 평평한 형태였다. 특히, 투과 전자현미경을 통한 관찰의 경우, 해수 아가미에는 염류세포의 바깥 표면에 apical crypt가 관찰된 반면, 15 psu 아가미의 염류세포에는 apical crypt가 관찰되지 않았다. 또한, 아가미의 표면이 pavement cell에 의해 외부환경과 차단되어 있는 형태였다. 시간별 혈장 Na+, K+, Cl- 및 osmolality은 4, 8, 24시간째에 대조구에 비해 낮은 경향을 보였지만 144시간째에는 세 실험군보다 높았다. 스트레스 지표인 glucose, AST, ALT의 경우, 4시간 째 AST를 제외하고 대조군 보다 낮았지만 144시간째는 다시 증가하는 경향을 보였다. 아가미의 Na+/K+-ATPase 활성은 15 psu로 전환된 후 4h, 8h, 24h구에서 활성이 증가되었다. 특히, 4h와 24h구에서 SW구와 유의차가 있었다. 그러나 48h와 144h구는 SW구의 수준과 비슷한 경향을 보였다. 그러므로 PRL의 발현, Na+/K+-ATPase 활성의 변화, 아가미의 조직학적 변화 그리고 삼투질 농도의 유지를 통해 A. melanopus은 15 psu 환경에서도 생존할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 보인다. 그러나 AVT와 IT가 144h에도 증가하는 경향을 보였고, 다소 높은 수치의 AST, 그리고 삼투질 농도가 다소 낮은 경향을 보인 점은 15 psu 환경이 A. melanopus에게 등장환경이기 보다 저장환경에 가까울 수도 있다는 것을 시사한다.