Microbiological and pathogenic characteristics of Vibrio scophthalmi isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus)

Abstract

2005년 부산, 포항, 제주도의 넙치 양식장에서 양식중인 넙치가 지속적인 폐사를 나타내어, 그 원인은 규명한 결과, 현재까지 넙치에서는 병원성 세균으로 알려지지 않은 새로운 Vibrio 속 어병 세균이 분리되었다. 본 연구에서는 새로 분리된 미지의 병원세균을 동정하고, 각종 미생물학적 특성과 병원성을 밝힘으로써 이 병원체의 감염증에 대한 대책 수립의 기초 자료를 확립하고자 한다.

1. 분리된 균주의 미생물학적 특성 2005년 병든 넙치에서 분리된 5균주의 표현형적 특성을 조사한 결과, 이 분리균주는 모두 10–30 ºC, 0.5–6% NaCl, pH 5–10의 범위에서 증식하였으며, 운동성이 있고 TCBS증식능이 있으나 용혈능은 없었다. 시험균주는 모두 lysine, ornithine decarboxylase, ONPG, indole 생성, MR, VP, citrate 시험에서 음성이며 urease, esculinase와 nitrate reduction반응에서 양성이었다. 또는adipate, fructose, D–glucose, D–maltose에서 산을 생성하며alkaline phosphatase, esterase lipase (C8), leucine arylamidase, Naphtol–AS–BI–phosphohydrolase, N–acetyl–β–glucosaminidase시험에서 양성 반응을 나타내었다. 분리균주의 유전적 특성을 밝히기 위해서 16S rRNA, gyrB 및 dnaJ 유전자배열을 분석한 결과, 분리균주의 16S rRNA 유전자는 Vibrio scophthalmi 및V. ichthyoenteri의 16S rRNA 유전자와 98–100%의 상동성을 나타내었다. 분리균주의 gyrB 및 dnaJ의 염기배열은 V. scophthalmi의 gyrB 및 dnaJ와 각각 81-87% 및 98% 이상의 상동성을 나타내어, 유전적 특성상 분리균주는 V. scophthalmi와 가장 유사한 것으로 나타났다. 이상의 결과에 따라 병든 넙치에서 분리된 균주는 V. scophthalmi로 동정되었다.

2. 넙치에 대한 시험균주의 병원성 넙치에 대한 분리 균주 LD50값은 106–108 CFU g-1 fish로서 균주에 따라 병원성에 차이가 있음을 알 수 있었다. 인위 감염시킨 시험어의 증상은 자연 발병어와 비슷하게 나타났으며, 병어에서는 체색 흑화, 간, 장, 근육 출혈, 복수 저류 및 복부 팽만 등을 볼 수 있었다. 병리조직학적 병변 조사 결과에서는 신장의 조혈부분 확장과 상피세포의 초자적변성, 비장의 macrophages infiltration과 ellipsoid area확장 및 장에서의 혈관 확장, 점막하 부종과 점막 염증 등을 관찰할 수 있었다. 시험균과 Streptococcus parauberis의 중복감염 (107 CFU fish-1)으로 폐사율은 25%에서 87.5%으로 증가하는 경향을 나타내었다. 질병 발생 기전을 밝히기 위해서, 병원성 인자인 adhesion ability, SOD, catalase activity, 시험어의 혈청, 점액 및 대식세포에 대한 생존능 등의 여러 가지 병원성 인자를 강독성균주(HVS) 와 약독성균주(LVS)의 균체를 사용하여 비교 연구하였다. 또한 병원성에 있어서 균체를 제외한 extracellular products(ECPs)의 작용 기전을 연구하기 위해서의 HVS와 LVS의 ECPs를 분리하여 넙치의 복강에 투여하였다. 시험균의 균체 시험 결과 HVS에서 SOD의 활성이 높고 신선 혈청 시험구의 18시간 째 세균 수가 2 log unit 증가한 반면 LVS 에서는 균수가 측정 수준 이하로 감소하였다. 점액에 대한 저항성 시험에서 HVS의 세포수는 증가를 보였으나 LVS시험구의 세균 세포 수는 정균상태를 나타내어 시험 균주 간에 뚜렷하게 유의적인 차이를 나타내었다. 그리고 ECPs 병원성 시험에서는 LD50 값이 HVS의 10.14와 LVS의 15.99 ㎍ protein g-1 fish 를 나타내었다. ECPs의 병원성 발현에는 naphtol–AS–BI–phosphohydrolase, 리파아제, 젤라티나아제, leucine arylamidase 등의 효소 활성이 관련할 것으로 생각된다.

3. 시험균에 대한 넙치 대식세포의 활성 HVS는 LVS에 비해 대식세포에서의 생존능이 높은 것으로 나타났으나, 식작용 활성 시험에서 대식세포가 두 시험균 모두 포식할 수 있으며, HVS와 LVS 사이에 유의적 차이를 나타내지 않았다. 대식세포의 호흡폭발능(ROS) 시험에서 세포외O2-와 세포내O2- 농도 모두 HVS 시험구보다 LVS 시험구에서 더 강하게 나타냈다. 그러나 산화질소(NO) 생산에서는 HVS 시험구가 LVS 시험구보다 유의적으로 높게 나타났다. 이상의 결과에서 본 시험균은 V. scophthalmi로 동정되었으며, 넙치에 병원성이 있는 것을 확인했다. 병원성 특성 조사 결과 V. scophthalmi는 넙치의 식세포내 증식가능하며, 넙치의 혈청과 점액의 살균 작용에 대한 저항성이 있었다. 그리고 ECPs에서도 병원성이 확인되어 ECPs도 병원성 인자임을 알 수 있었다.