넙치, Paralichthys olivaceus에서 분리한 Streptococcus parauberis의 혈청학적 특성 및 병원성

Abstract

요 약

2005년 이후부터 우리 나라의 주요 어병 세균의 일종으로 S. parauberis가 우점적으로 분리되고 있지만, 현재까지 이 세균의 독성 인자나 병원성 기작에 대하여 거의 연구되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 S. parauberis의 혈청학적 특성과 넙치와 강도다리의 비특이적 면역 반응에 대한 저항성 반응을 비롯한 병원성을 조사하였다. 그리고 병원성 인자로 주목 받고 있는 협막을 결여시킨 pgmA allelic exchange mutant를 제작하여 그 특성을 알아봄으로써 병원성 인자를 밝히고자 하였다.

1. S. parauberis의 분리 및 동정

2002년부터 2005년에 걸쳐 전국의 어류 양식장을 대상으로 하여 어병 세균을 분리 동정한 결과 2003년에는 E, tarda가 단독 감염 병원체으로서 우점종이었으나, 2005년에는 S. parauberis가 우점종으로 밝혀져 이 세균에 의한 질병 발생이 증가되고 있는 것을 알 수 있었다. 제주도, 전남 및 경북의 양식장으로부터 넙치와 강도다리에 피해를 일으키는 49개의 S. parauberis 균주를 분리하고, 생화학 시험과 PCR을 이용하여 동정하였다. S. parauberis로 동정된 분리 균주는 고염분 (5%)에서도 증식하였고, 모두 부분 용혈을 일으키는 α-hemolysis로 확인하였으며, 여과 멸균 사육수에서도 60 일 이상의 survival을 보였다.

2. S. parauberis의 혈청학적 특성

넙치와 강도다리에서 분리한 S. parauberis의 혈청형을 구분하기 위하여 KSP20와 KSP14의 대표 균주 토끼항혈청을 각각 항혈청 Type Ⅰ과 Type Ⅱ라 정하고 이를 이용한 FKCs와의 응집 항체가와 내열성 항원을 이용한 immunological double-diffusion 시험에서 KSP20 균주로 대표되는 Type Ⅰ형과 KSP14로 대표되는 Type Ⅱ로 제안하였다. 강도다리 유래의 균주 PH0710과 PH0711을 포함한 47 개의 분리 균주가 Type Ⅰ에 속하고, 2 개의 분리 균주와 참조 균주 KCTC 3651은 어느 type에도 속하지 않았다. 넙치와 강도다리 점액과 혈청 내 생존능에서 Type I으로 구분한 KSP20과 PH0710 균주가 각각의 분리 유래에 해당하는 넙치와 강도다리의 점액과 혈청에서 높은 생존능과 증식성을 나타내었다. 넙치와 강도다리의 단층 leucocytes에서 adhesion과 invasion을 나타내었다. Leucocytes 세포 내에서 2 일 이상 생존하는 것으로 나타났다.

3. S. parauberis의 병원성

S. parauberis 분리 균주와 참조 균주는 40g의 넙치를 대상으로 1×108 CFU/fish와 1 × 105 CFU/fish로 i.p. injection 하거나 5 × 107 CFU/ml로 해수 현탁액에 2 시간 침지 시험구에서는 거의 폐사가 나타나지 않았다. 그러나 넙치에서도 1×107 CFU/fish로 i.p. injection 후 먹이 투여 시험구에서는 15일 내에 90%의 누적폐사율을 나타내었다. 강도다리 공격 시험에서는 1×106 CFU/fish으로 i.p. injection 시험구에서 강도다리 유래의 PH0710에서만 80%의 누적폐사율을 나타내었다. S. parauberis의 인위 감염 후 혈액 성상 조사 결과, 강도다리 시험구에서 1 일째부터 지속적으로 hematocrit 치가 급격히 감소되었으며,, Type I형 균주인 KSP20과 PH0710에서 혈청 내 total protein의 농도가 증가되었다. S. parauberis의 인위 감염 후 혈액과 장기 조직 내의 세균 수를 측정한 결과 비장, 신장, 심장, 뇌 및 혈액 순으로 높은 수의 S. parauberis 세균이 검출되었고, 넙치에서는 3 일째에 가장 높은 수의 세균이 검출되고 7 일째에 감소하는 경향을 나타내는 반면에 강도다리는 7 일째까지 계속 증가하는 것으로 나타났다. 혈청 lysozyme 활성과 NBT 환원능은 S. parauberis의 인위 감염에 따라 그 활성이 증가하였으며, 대조구에 비해 유의적으로 활성화되는 시간은 차이가 있어, 넙치와 강도다리에서 어종에 따른 반응성의 차이를 알 수 있었다. S. parauberis의 pgmA을 클로닝하고, 이 pgmA gene의 역할을 규명하기 위해 temperature-sensitive shuttle vector를 이용한 allelic exchange 통해서 pgmA knockout 시킨 KSP20의 mutant 균주, M-KSP20을 제작하여 표현형적 특징과 넙치의 면역 반응에 대한 저항성 및 병원성을 조사하였다. S. parauberis mutnat M-KSP20은 buoyancy의 감소와 hydrophobicity의 증가를 나타내고, TEM 결과 협막이 결여되는 표현형적 특징을 나타내었다. 또한 M-KSP20은 wild type에 비해 넙치의 점액과 혈청 내 생존능에서 유의적인 감소를 나타내었고, leucocytes 내에서도 adhesion과 invasion은 증가하였으나, 48 시간 내에 세포내에서 생존하지 못하고 제거됨을 확인하였다. 게다가 S. parauberis mutant M-SP20은 넙치에 대해 병원성을 거의 나타내지 않았다. 그러므로 본 연구의 결과와 같이 S. parauberis의 pgmA gene이 협막의 생성에 관여하고 점액과 혈청 내의 생존능, 식세포 내의 survival 등과 관련이 있으며, 이는 병원성과 직접적인 연관 관계가 깊은 것으로 생각된다.

Serological characteristics and pathogenicity of Streptococcus parauberis isolated from olive flounder, Paralichthys olivaceus

Sung Ho WOO

Department of Fish Pathology, Graduate School, Pukyong National University

Abstract

Streptococcus parauberis has been recognized as one of the most dominantly isolated fish pathogenic bacteria in South Korea since 2005. Until now, little has been known about virulence factors and pathogenic mechanisms of S. parauberis infection. Therefore, this study attempted to investigate serological characteristics and virulence of S. parauberis, as well as immune responses of olive flounder, Paralichthys olivaceus and starry flounder, Platichthys stellatus against S. parauberis infection in order to elucidate virulence factors and pathogenic mechanisms. In addition, an allelic exchange mutant of pgmA, one of the major virulence factors of streptococcal bacteria, gene was generated to identify the virulence factors.

1. Isolation and identification of Streptococcus parauberis in South Korea

Increased outbreak of the disease by S. parauberis has been found from the results of bacterial pathogen by monitoring fish farms across the country from 2002 to 2005. According to the results, the dominant species isolated from diseased fish was turn out to be Edwardsiella tarda in 2003. However, it was changed to S. parauberis in 2005. Such findings revealed that the latter became more prevalent than the former. In this study, 49 strains isolated from the diseased farmed olive flounder and starry flounder in Jeju Province, Jeollanam Province, Gyeongsangbuk Province were identified as S. parauberis using biochemical tests and specific PCR. These isolates indicated proliferation in high salt medium (5%), α-hemolysis, and were survived in sterile filtrated rearing water for 60 days or more.

2. Serological characteristics of S. parauberis

For the determination of serotypes, Type Ⅰ and Type Ⅱ rabbit antisera were produced using KSP20 and KSP14 as representative strains of tested isolates, respectively. Forty seven isolates were divided into two serotypes, Type Ⅰ and Type Ⅱ in agglutination test using FKCs and immunological double-infusion test using autoclave extracted antigens. Two isolates and KCTC 3651 did not belong to any of those. Most strains including PH0710 and PH0711, which were isolated from starry flounder, belonged to Type Ⅰ serotype. Of 49 isolates, KSP20 and PH0710, which were included in Type Ⅰ serotype, indicated the highest viability and proliferation in mucus and serum of olive flounder and starry flounder, respectively. S. parauberis isolates showed adhesion and invasion abilities in the macrophage-enriched cells of olive flounder and starry flounder. In survival assay, S. parauberis could survive upto 2 days in the fish leucocytes.

3. Pathogenicity of S. parauberis

S. parauberis isolates did not kill fish when the 40 g of olive flounder got experimentally infected by intraperitoneal injection with 1×108 CFU/fish and 1×105 CFU/fish or immersion with 5×107 CFU/ml for 2 hours. However, the olive flounder fed after injected with 1×107 CFU/fish of S. parauberis showed 90 % of cumulative mortality within 15 days. In case of starry flounder, fish injected with only 1×106 CFU/fish of PH0710 strain, which was isolated from starry flounder, showed 80 % cumulative mortality. In case of starry flounder, hematocrit value was dramatically decreased at 1 day after experimental infection of S. parauberis PH0710 and total protein concentration of fish was increased by artificial infection of Type Ⅰ serotype KSP20 and PH0710. The recovered bacterial number of S. parauberis after experimental infection was highest in spleen, followed by kidney, heart, brain and blood in order. The highest number of bacteria was detected three days after injection and the bacterial number was decreased 7 days after injection in olive flounder whereas the bacterial number was increased 7 days later after injection in starry flounder. Serum lysozyme activities and NBT reduction were increased by experimental infection of S. parauberis, and the activated time points at which the activities were significantly higher than control were different in between olive flounder and starry flounder. PGM proteins of a variety of Gram-positive and Gram-negative bacterial pathogens have recently been identified to play a key role in polysaccharide capsule production and virulence. In this study, pgmA gene of S. parauberis was cloned, phenotypic characteristics and pathogenicity were investigated using a pgmA gene-knockout mutant of KSP20 (M-KSP20) generated by allelic exchange with the temperature-sensitive shuttle vector system. Compared to wild-type S. parauberis KSP20, pgmA-knockout mutant M-KSP20 revealed a reduction of the buoyancy and increased hydrophobicity. Transmission electron microscopy confirmed lack of extracellular capsular polysaccharide. Survival of mutant strain in mucus, serum of olive flounder was significantly decreased than that of wild type strain. On top of that, the mutant strain was eliminated from leucocytes after 48 hrs and could not kill flounder as wild type strain in spite of its increased adhesion and invasion abilities to flounder leucocytes. Based on these findings, the pgmA gene could be required for virulence in S. parauberis, playing a pivotal role in surface capsule formation, survival in skin mucus and serum, and resistance to host phagocyte killing.