Anti-oxidative effect of eckol on HepG2 cells via up-regulation of heme oxygenase-1 expression

Abstract

Eckol은 식용갈조류인 곰피(Ecklonia stolonifera)로 부터 분리된 phlolotannin의 유도체로서 항산화, 방사선방호, 항고지혈증, 항치매, 항노화, 항균성활성, 플라스민저해와 같은 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 정상인간 간세포의 특징을 가지고 있고, in vitro상에서 간독성 및 생체이물대사의 모델로 이용되고 있는 HepG2(Human liver hepatocellular carcinoma)세포주를 이용하여 eckol의 항산화 및 간보호 효과를 조사하였다. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용하여 eckol의 항산화능을 조사한 결과 10 μM에서 80 μM까지 농도의존적으로 항산화 효과가 있음을 확인하였고, 특히 40 μM에서 급격한 효과가 나타났다. 이 농도를 기준으로 하여 HepG2세포에 eckol을 10 μM, 20 μM, 40 μM농도로 처리하여 독성이 없음을 확인한 후 이후 실험을 진행하였다. Eckol 처리 이후 대표적인 항산화 효소인 heme oxyganase-1(HO-1)의 단백질 발현이 12시간에서 최대가 되었고 HO-1의 단백질 및 mRNA 발현이 농도의존적으로 증가하였다. 따라서 HO-1의 발현은 번역단계뿐만 아니라 전사 후 단계에서도 조절됨을 확인하였다. Eckol 처리 2시간 전에 단백질 합성 저해제인 Cycloheximide(CHX)를 전 처리한 결과 HO-1의 발현이 억제되었고 이는 eckol에 의한 HO-1의 발현은 de novo 단백질 합성에 의한 것임을 의미하는 것이다. HO-1의 유전자 발현은 전사인자인 NF-E2-related factor-2(Nrf2)의 활성화와 밀접하게 연관되어 있다. 따라서 eckol에 의한 HO-1의 발현에 Nrf2의 활성화가 관련되어 있는지 알아보고자, HepG2세포의 세포질과 핵추출물을 분리하여 Nrf2의 활성화를 분석하였다. Eckol처리에 의해 Nrf2가 활성화되어 세포질에서 핵으로 이동하였음을 확인하였고, Nrf2의 전사활성은 eckol의 처리농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. Nrf2를 통한 HO-1의 발현은 Akt와 Mitogen-activated protein kinase(MAPK)경로에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 eckol처리에 의한 이들 경로의 활성화를 조사한 결과, Akt, Extracellular signal-regulated kinases(ERK), c-Jun N-terminal Kinase(JNK) 모두가 인산화 됨을 확인하였고, 이들 효소의 저해제를 eckol과 함께 처리한 결과 HO-1의 발현이 감소되는 것으로 나타났다. eckol에 의한 HO-1 발현의 증가는 eckol이 HepG2세포에서 Akt와 MAPK경로를 활성화시키고, 이로 인해 HO-1의 전사인자인 Nrf2가 활성화되어 핵으로 이동함으로써 나타나는 것임을 알 수 있었다. Eckol에 의한 세포보호작용을 알아보기 위해서 HepG2세포에 t-BHP를 처리하여 산화적 스트레스를 유발하였고, 이에 대한 eckol의 효과를 조사하였다. Eckol은 t-BHP처리에 의해 생성되는 free radical을 효과적으로 제거하는 것으로 나타났고, 또한 HO-1의 발현증가, Akt, ERK, JNK의 인산화, 그리고 Nrf2의 활성화를 유도하는 것으로 확인되었다. 이상의 결과에서 HepG2세포에 대한 eckol의 처리는 HO-1 발현의 증가에 따른 항산화 효과를 보여주었고 t-BHP에 의해 생성된 산화적 스트레스의 감소를 통해 세포보호작용을 나타내는 것으로 확인되었다.