Anti-proliferative mechanism of Laminaria japonica glycoprotein on human colon cancer cells

Abstract

해조류는 미네럴, 비타민, 단백질 그리고 탄수화물과 같은 다양한 유용성분이 많이 포함되어 있으며, 오래 전부터 식용 또는 의료분야에서 이용되어 왔다. 다시마Laminaria japonica (L. japonica)는 중국, 일본, 그리고 한국에서 조미료나 사료로 소비되고 있으며 식이섬유의 효과에 대해서는 많이 알려져 있지만 다른 생리활성에 대해서는 아직까지 많이 알려져 있지 않았다. 이번 연구에서 다시마부터 항암효과를 가진 당단백질(LJGP)을 추출하였고 HT-29 대장암세포와 IEC-6 정상소장상피세포를 이용하여 그 작용 메카나즘에 대해서 살펴보았다. MTS assay결과에 따르면 LJGP는 HT-29 세포의 증식을 농도의존적으로 억제시켰다. 또 현미경사진결과에 따르면 세포의 구형화, 수축, plate부터의 분리과 같은 형태학적인 변화가 나타났다. 이런 형태학적인 변화는 anoikis의 특징으로 알려져 있다. Anoikis는 일종의apoptosis로 세포외기질과의 부착력 감소와 세포외기질과의 부적절한 부착이 원인이 되어 일어나는 apoptosis이다. 다세포생물은 성장, 및 생존하기 위해서는 이웃 세포나 세포외기질에 결합해야 하고 세포가 세포외기질로부터 떨어지면 anoikis가 일어난다. 그러므로anoikis는 부적절한 부위에서의 바람직하지 않는 세포 증식을 억제시켜서 정상조직의 발달과 조직화에 있어서 중요한 역할을 한다. 앞서 보여진 형태학적인 변화로부터 LJGP가 HT-29 세포에서 anoikis를 유도하는 것을 확인하였으므로 LJGP에 의한 anoikis 메커니즘에 대해서 알아보고자 하였다 우선 matrix metalloproteinase (MMP)와tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)가 LJGP에 의한 anoikis에 관여하는지를 알아보기 위해서 MMP-2, MMP-9그리고 TIMP-1의 발현 수준과 MMP-2와 MMP-9의 효소활성에 대해서 살펴보았다. MMP라는 것은 extracellular matrix (ECM)성분이나 부착관련분자들을 분해하는 protease이다. LJGP를 처리하였을 때 MMP-2와 MMP-9의 발현 수준은 증가하였지만 TIMP-1의 발현 수준은 감소하는 것으로 나타났다. MMP효소활성을 보기 위해서 zymography를 한 결과 MMP-2와 MMP-9 모두 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 다음으로 세포의 생존이나 증식, 그리고 이동에 중요한 부착단백질인 integrin αν, β3, β5, β6 그리고 Epithelial (E)-cadherin의 발현 수준을 살펴보았다. LJGP는 이 부착분자들을 모두 감소시키는 것으로 나타났다. 그외에도LJGP는 integrin하위인자인 focal adhesion kinase (FAK), Src (family of protooncogenic tyrosine kinase), p85, Akt, extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2)의 활성을 억제시키고 p38의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이 분자들은 integrin-mediated survival signaling pathways에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. E-cadherin 발현 감소와 마찬가지로, LJGP는 β-catenin과 E-acdherin 간의 결합을 감소시켰다. 그리고 β-catenin의 핵으로의 이동 억제와 β-catenin의 표적인자인 cyclin D1과 c-myc의 발현 수준의 감소가 일어났다. 이상의 결과들로부터, LJGP는 integrin을 통한 survival signaling pathway과 E-cadherin을 통한 survival signaling pathway를 억제시켜서 anoikis를 유도하는 것으로 보인다. 독특한 정의에도 불구하고 anoikis는 근본적으로 apoptosis과정과 동일하다. anoikis의 개시와 실행은 여러 경로를 통해서 일어나며 이 모든 것이 caspases를 활성시키고 결국은 endonucleases, DNA fragmentation, 세포사멸을 일으키게 된다. 또 anoikis는 mitochondria막 전위의 변화 그리고 세포표면 death receptor (DR)의 활성화로 일어나는 것으로 알려져 있다. LJGP를 처리하였을 때 HT-29 세포에서 apoptotic bodies출현, sub-G1 arrest, caspase-3 activation, 그리고 poly (ADP-ribose)polymerase (PARP) degradation과 같은 여러 apoptosis 특징이 나타났다. sub-G1 arrest 결과와 마찬가지로, LJGP는 세포주기 G1기에서 S기 진행 조절인자인 cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2), cyclin E1, proliferation cell nuclear antigen (PCNA), E2F1, 그리고 인산화 retinoblastoma protein (Rb)의 발현을 감소시키고 p27의 발현을 증가시켰다. LJGP는 Fas, Fas-associated death domain (FADD), caspase8로 구성되는 death-induced signaling complex (DISC) 형성과 B-cell lymphoma 2 (Bcl2) family와 caspase9 활성화로 인한 mitochondria막potential의 감소를 유도하는 것으로 나타났다. 이상 결과는 LJGP 가 G1 arrest, death receptor signaling pathway의 유도, 그리고 mitochondria막 전위의 감소를 통해서 HT-29 세포에서 anoikis를 유도하는 것을 보여주고 있다. LJGP는 IEC-6세포 증식을 촉진시키는 것으로 나타났다. LJGP작용메커니즘을 알아보기 위해서 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 와 phosphatidylinositol-3kinase (PI-3K)/Akt 가 관여하는 epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathways 에 대해서 살펴보았다. 이 pathway는 세포 분화와 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. Immuoprecipitation과 Western blotting결과에 따르면 LJGP는 EGFR과 Shc의 인산화 그리고 Shc과 growth-factor-receptor-bound protein-2 (Grb2)의 결합을 유도시켰다. LJGP는 Shc과 Grb2의 하위인자인 ERK1/2, the c-Jun N-terminal kinase (JNK), 그리고 p38의 인산화에도 영향을 미치는 것으로 나타났다. ERK1/2의 인산화가 증가하였고 JNK과 p38의 인산화는 감소하였다. 또PI-3K/Akt signaling pathway의 구성인자인p85와 Akt의 발현 수준은 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 결과들로부터LJGP가 MAPK와 PI-3K/Akt signaling pathways을 통해서 IEC-6세포의 증식을 유도하는 것을 알 수 있다. 따라서 LJGP는 소화관세포에 대해서 다른 두가지의 효과를 보여주는 것으로 나타났다. 하나는 HT-29 대장암 세포 증식 억제효과이고 이것은 부착분자를 통한 survival signaling pathway의 억제, G1 arrest, death receptor signaling pathway 촉진, 그리고 mitochondria막 전위저하로 인한 anoikis 로 인해 유도되는 것으로 나타났다. 또 하나는 IEC-6소장상피세포의 증식 촉진효과이고 이것은 MAPK과 PI-3K/Akt signaling pathways의 의존하는 것으로 나타났다.