Mass production of recombinant E. coli K-12 ghost vaccine against streptococcal disease

Abstract

어류 단백질 섭취의 증대에 따라 수산 양식업이 다양화되고 생산이 증가함으로써 양식 해양생물의 질병으로 인한 피해가 증대되고 있는 가운데 특히 양식어류는 고밀도 사육 및 사육환경 악화 등 여러 가지 스트레스 요인으로 질병 발생빈도가 높아져 많은 피해를 입고 있다. 이와 같은 어병 피해의 예방대책으로서 대부분 항생제와 같은 항균성 의약품 등의 투여에 의한 피해경감에 의존하고 있는 실정이며, 2008년도 국내에서는 1조 625억원어치의 항생제 중 50% 이상이 축산•수산용으로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 항균성 의약품 등의 사용은 약제 내성균의 증가, 약제의 어체 내 잔류에 의한 식품 위생상의 문제 및 환경으로의 확산에 의한 공중위생상의 문제를 내포하고 있으며, 더구나 최근 양식 및 재배어업을 목표로 하는 종묘생산의 현장에 있어서, 항균성 의약품으로는 치료할 수 없는 바이러스성 질병이 만연하여 심각한 사태가 발생하여 질병감염의 문제가 더욱 심화되고 있다. 또한 무분별한 항생제 남용, 약제처리 미숙 등 양식어류의 잔류 항생제 축적에 대한 소비자들의 불신이 팽배해 있으며, 특히 투여된 항생제가 수중에 직접 노출될 수 있는 양식장의 항생제 남용은 생태계 파괴의 논란이 끊이지 않고 있다. 따라서 항생제 사용에 의한 부작용을 최소화하기 위해서는 백신을 통한 질병 예방 전략이 필수적인데 백신은 어류의 세균성, 바이러스성 질병의 발병률을 획기적으로 줄일 수 있는 비용 대비 효과가 가장 큰 의약품으로 알려져 있다. 어류 양식분야에서도 생산성 향상 및 친환경적으로 건강한 어류 생산을 위해 필요한 기술이며 또한 날로 그 중요도가 증가하고 있는 추세이다. 본 연구는 유해한 화합물 및 열처리를 통한 사균 생산 방식에서 완전히 탈피하여 생체의 항원성을 가장 효과적으로 보존시킬 수 있는 기술로서 고스트화 세균, 유전자 및 항원 전달시스템 기술을 통한 해양생물의 세균성 질병에 대한 백신전략으로 사용하고자 한다. 본 연구에서는 연쇄구균증의 주요 원인종의 하나인 Streptococcus iniae에 대한 백신을 개발하기 위해 고스트 박테리아 기술을 도입하였다. 고스트 박테리아 기술이란 세균의 벽에 미세하게 작은 구멍을 인위적으로 유도함으로써 세균의 세포질 성분을 밖으로 유실토록 하는 기술로서 세균 자체는 생존능력이 없으나 세포 표면의 물리적 및 화학적 구성은 완벽히 보존시킬 수 있는 장점을 갖고 있어 우수한 안정성과 동시에 생균에 버금가는 항원성을 보존시킬 수 있다. 또한 다량의 세포질이 제거됨으로써 항원성 전달의 높은 효율과 비특이적인 면역억제 등을 최소화 시킬 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하여 생산된 백신을 유가식 배양을 통해 대량생산하여 산업화에 있어 높은 경쟁력을 확보하기위한 연구를 수행하였다. 본 연구에서는 타겟 antigen으로 GAPDH를 선택하였고, 이와 함께 항원의 표면 발현을 위한 InaN 신호서열과 고스트 생성을 위한 ghost 27 SDM cassette가 포함된 재조합 플라스미드를 cloning 하여 E. coli K-12에 형질전환 시켰다. E. coli K-12는 인간이나 동물, 식물 등에 전혀 위해하지 않으며 high volume 및 high cell density를 목적으로 주로 이용되어져왔다. 따라서 본 연구에서는 고스트 백신의 산업화를 위해 host cell로 E. coli K-12를 선택하였다. Cloning된 재조합 균주인 E. coli K-12/pHCE-InaN-antigen-ghost27 SDM를 고스트 백신의 산업화를 위해 5 L 발효기를 이용하여 최적 탄소원, 교반속도, 산소공급 조건 등의 최적 배양조건을 검토하였고, 고스트 발현 유도를 위한 온도조절과 고스트 별현 효율 최적화를 위한 연구를 수행하였다. 그 결과 최종적인 발효조건으로 최적 탄소원은 glucose, 교반속도는 300 rpm, 산소 공급조건은 2.0 vvm으로 결정하였다. 5 L 발효기를 이용하여 working volume 2.5 L로 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양은 총 4단계로 나누어져 수행되었으며, 1단계는 intial batch phase, 2단계는 균의 대량생산을 위하여 fed-batch phase를 수행하였다. 3단계는 induction phase로 온도를 27℃에서 42℃로 증가시켜 Lysis E gene을 발현시켜 대량생산된 균을 고스트화 시켰다. 4단계는 high temperature holding phase로 온도를 42℃에서 47℃로 2시간동안 증가시켜 고스트 박테리아 백신 생성 효율을 99.9%로 끌어올렸다. 또한 42℃에서 47℃로 온도가 증가함에 따른 표면 단백질에 끼치는 영향을 알아보기 위해 outer-mambrane protien fractionation 실험을 수행하였다. 그 결과 온도가 42℃에서 47℃로 증가함에 따른 표면 발현 단백질에는 크게 영향을 주지 못한 반면, 49℃로 온도를 올렸을 때는 표면 발현 단백질에 영향을 주는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 고스트 생성 효율을 증가시키기 위한 최적 증가온도로서 47℃를 선택하였다. 최종적으로 생산된 고스트 백신의 생산량은 34.9 g dcw/L를 나타내었다. 이는 종래의 E. coli XL1-blue를 이용한 고스트백신의 생산량인 22 g dcw/L보다 높은 생산성을 나타내었다. 국내 양식 어류종인 넙치를 대상으로 S. iniae 백신에 대한 효능을 검증하고자 challenge test를 실시하였다. 2 주일 간 누적 폐사율을 관찰한 결과 최종 누적 폐사율은 positive control, E. coli K-12 host strain control group 그리고 E. coli K-12/pHCE vector control group의 경우 누적 폐사율은 100%로 나타났으며, fomalin-killed cell (FKC) vaccine을 처리한 group의 경우 65%의 누적 폐사율을 보인 반면, 생산된 고스트 백신을 처리한 group인 GBV42와 GBV47의 경우 50%로 동일한 누적 폐사율을 나타내었다. 이와 같은 백신 효능 검증 결과 본 연구를 통해 대량 생산된 고스트 백신이 FKC vaccine보다 면역 효과가 크다는 것을 확인할 수 있었고, 이는 E. coli K-12를 이용한 고스트 백신이 양식 산업에 있어 효과적이면서도 상업적으로 유용한 백신으로 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.