Molecular cloning, expression, characterization and enzymatic analysis of cathepsin L from starfish (Asterina pectinifera)

Abstract

Cathepsin L은 단백질 분해의 초기과정에 관여하는 cysteine protease들 중 하나이다. 본 연구는 기존의 알려진 유사 유전자 서열 정보를 바탕으로 하여 RACE를 수행, 별 불가사리 cathepsin L(ApCtL)의 cDNA를 클로닝하였다. 별 불가사리로부터 동정된 cathepsin L 유전자는 327개의 아미노산을 암호화하는 984 bp의 open reading frame을 가진다. Cathepsin L의 propeptide region 내에 ERF/WNIN motif가 존재함으로써 이것이 명백하게 cathepsin L group이라는 것을 보여주며, 계통 유전학적 분석 결과 다른 종의 cathepsin L에 비해 초창기에 분화되어 나온 것으로 사료된다. RT-PCR을 수행한 결과, 별 불가사리의 조사된 모든 조직에서 cathepsin L이 발현되는 것을 볼 수 있었다. Pro-mature enzyme인 proApCtL은 fusion protein인 glutathione S-transferase를 포함하는 pGEX-4T-1 vector에 삽입하여 E.coli 균주인 DH5α 내에 과발현시켰다. 재조합 단백질인 proApCtL은 61KDa의 분자량을 가진다. proApCtL의 활성은 gelatin zymography를 통한 방법과 fluorogenic 펩타이드 기질인 Z-Phe-Arg-AMC을 이용한 방법으로 측정되었다. 적정 pH는 pH 8.0 이다.

Cathepsin L is a member of cysteine protease, which is important protease in the initiation of protein degradation. In this study, the cDNA of starfish (Asterina pectinifera) cathepsin L (ApCtL) was cloned by the combination of homology molecular cloning and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length of ApCtL gene contains an open reading frame of 984bp encoding 327 amino acids. The presence of ERF/WNIN motif which is conserved in the propeptide region of cathepsin L clearly reveals that ApCtL is cathepsin L group. Phylogenetic comparisons of ApCtL to other cathepsin groups have shown ApCtL in the early lineage of the cathepsin L group. The results of RT-PCR analysis show expression pattern of ApCtL observed in all of the tissues. The pro-mature enzyme of ApCtL (proApCtL) was overexpressed in E.coli DH5α as a fusion protein with glutathione S-transferase in pGEX-4T-1vector. The molecular weight of recombinant proApCtL was a 61 kDa. The activity of proApCtL was detected by gelatin zymography and cleaving synthetic fluorogenic peptide substrates, Z-Phe-Arg-AMC. The optimal pH for the protease activity was 8.0.