Vibrio anguillarum의 groESL gene cluster 분리 및 groEL 유전자의 PCR을 이용한 특이적 검출법의 개발

Abstract

Vibrio anguillarum은 호염성, gram-negative의 대표적인 어류병원성 수·해양 미생물로 fish와 shellfish에 septicemia과 vibriosis를 유발한다. 이러한 V. anguillarum을 PCR을 이용하여 sensitive하고 specific하게 검출하고자, 본 연구에서는 V. anguillarum의 chaperonin을 encoding하는 groESL 유전자를 동정하였다. groE gene cluster에는 291 bp의 groES 유전자와 69 bp의 ingergenic spacer region, 그리고 1,635 bp의 groEL 유전자가 순차적으로 배열된다. groESL 유전자 염기서열의 분석 결과, V. anguillarum만을 특이적으로 검출하기 위해서는 groES gene 보다는 groEL gene이 더 적절한 것으로 나타났다. V. anguillarum은 V. ordalii와 매우 유사하기 때문에 V. anguillarum을 특이적으로 구별하는 것은 매우 어렵다. 따라서 두 species의 groEL 유전자를 비교하여 유사도가 가장 낮은 region을 선정하여 primer set을 design하였다. groEL primer set은 여섯 serotype의 V. anguillarum에서 195 bp의 뚜렷한 PCR amplicon이 나타난 반면, V. ordalii를 포함한 23 종의 Vibrio sp.와 10종의 enteric bacteria에서는 amplicon을 관찰할 수 없었다. V. anguillarum이 감염된 넙치와 굴 조직에서 groEL primer set을 이용하여 PCR을 통해 specific하게 V. anguillarum을 검출 할 수 있었다. 본 연구는 이러한 결과를 바탕으로 groEL 유전자를 target으로 한 PCR assay를 V. anguillarum의 검출을 위한 sensitive하고 species-specific한 tool로 제안하고자 한다.

Vibrio anguillarum is a major pathogenic bacterium that causes vibriosis and septicemia in fish and shellfish. In this study, we identified the groESL genes, which encode bacterial chaperonins, from V. anguillarum. The groE gene cluster consisted of a 291-bp groES gene, a 69-bp intergenic spacer region, and a 1,635-bp groEL gene order. Sequence analysis with the groESL gene of Vibrio species exhibited that the groEL gene was more species specific and suitable than the groES gene for V. anguillarum detection. Owing to the difficulty in distinguishing V. anguillarum from the closely related V. ordalii, we compared the sequences of groEL from V. anguillarum and the groEL homolog hsp60 from V. ordalii, in order to design a primer set based on a region dissimilar between the two. PCR with the groEL primer set produced a clear 195-bp amplicon in six serotypes of V. anguillarum, whereas 23 Vibrio species of 39 samples, including V. ordalii, and 10 species of enteric bacteria gave no bands. PCR using the groEL primers also amplified a unique product from V. anguillarum-infected flounder and oyster tissues. These results demonstrate that the groEL-target PCR assay is a sensitive and species-specific tool for the detection of V. anguillarum infection.