별 불가사리 (Asterina pectinifera)의 근육으로부터 새로운 항균활성 펩타이드들의 정제 및 특성
- Alternative Title
- Purification and characterization of the novel antimicrobial peptides from the muscle of starfish, Asterina pectinifera.
- Abstract
- The acidified dorsal retractor muscle (DRM), gill and perivisceral coelom extract of starfish showed strong antimicrobial activity against B. subtillus KCTC 1021. To purify the antimicrobial peptides, the acidified extract was partially separated with Sep-Pak C18 solid-phase extraction cartridges using stepwise gradient while increasing the percent of acetonitrile (10%, 60%, 100%) containing 0.1% TFA. Antimicrobial activity was recovered in the 60% acetonitrile fraction and this fraction was further isolated by cation-exchange, C4 and C18 reversed-phase high performance liquid chromatography. For the characterization of the purified peptides, the molecular weights and amino acid sequences analysis were performed by MALDI-TOF MS, ESI-Q-TOF MS and Edman degradation. In this study, the three novel antimicrobial peptides were purified from the DRM, gill and perivisceral coelom of starfish. For convenience, we have named these SFM-I, II and III. The molecular weights of SFM-I and SFM-II were 1602 and 4027 Da, respectively. The amino acid sequences of SFM-I and SFM-II were as follows: FGKGGAYDPLSAGFTD and GRKGRKGVRGNPFFNCEDEFGNPGCVCDKRKGGAAVTC. In particular the native SFM-II showed a broad spectrum activity against bacteria and fungi, but SFM-I had no activity. To investigate the prepro-sequence of SFM-II, cDNA work is in process. According to the EMBOSS garnier tool program, it was predicted that SFM-II will take a β-sheet structure containing turn and coil part. Finally, the molecular weight of SFM-III turned out to be 2404 Da. The partial amino acid sequences of purified SFM-III was as follows: DSPHYXTRHLGTKIGQIXGWH. These peptides may play an important role in the innate immunity of starfish.
- Issued Date
- 2011
- Awarded Date
- 2011. 2
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Alternative Author(s)
- Woo, Kyung Eun
- Affiliation
- 부경대학교 수산과학대학원
- Department
- 대학원 생물공학과
- Advisor
- 박남규
- Table Of Contents
- Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 3
1. 재료 3
1.1. 실험동물 3
1.2. 시약 및 재료 3
2. 실험방법 3
2.1. 추출 3
2.2. 항균활성 측정 5
2.2.1. 배지의 제조 5
2.2.2. RDA 6
2.3. 항균활성 물질의 정제 7
2.3.1. SFM-I 의 정제과정 7
2.3.2. SFM-II 의 정제과정 9
2.3.3. SFM-III 의 정제과정 9
2.4. 천연 및 합성 펩타이드들의 분자량 및 아미노산 서열결정 9
2.4.1. 분자량 측정 9
2.4.2. 아미노산 서열 결정 10
2.5. DTT 처리로 인한 S-S bond 유무 확인 10
2.6. cDNA cloning 10
2.6.1. Total RNA 추출 10
2.6.2. Reverse transcription 11
2.6.2.1 First-Strand cDNA Synthesis for 3' RACE 11
2.6.2.2 First-Strand cDNA Synthesis for 5' RACE 11
2.6.3. Primer design 12
2.6.4. cDNA cloning for the complete coding sequence of SFM-II 13
2.6.4.1. 3 RACE PCR 13
2.6.4.2. 5 RACE PCR 13
2.6.5. Gel Isolation 14
2.6.6. Ligation of PCR products 14
2.6.7. Transformation 15
2.6.8. Colony PCR 15
2.6.9. Extraction of plasmid DNA 15
2.6.10. Sequencing analysis 16
2.7. 2차구조 예측 16
2.8. SFM-I, -II, -III의 특징연구 16
Ⅲ. 결 과 17
3. SFM-I 의 정제 및 특징 17
3.1. SFM-I 의 정제 17
3.2. SFM-I 의 분자량 및 아미노산 서열 22
3.3. SFM-I 의 항균 활성 22
3.4. SFM-I 의 특징 및 2차 구조 예측 22
4. SFM-II 의 정제 및 특징 27
4.1. SFM-II 의 정제 27
4.2. SFM-II 의 분자량 및 아미노산 서열 27
4.3. SFM-II 의 분자 내에 S-S bond의 유무 확인을 위한 DTT 처리 33
4.4. SFM-II 의 3RACE 및 5RACE 결과 33
4.5. SFM-II 의 항균 활성 39
4.6. SFM-II 의 특징 및 2차 구조 예측 39
5. SFM-III 의 정제 및 특징 42
5.1. SFM-III 의 정제 42
5.2. SFM-III 의 분자량 및 아미노산 서열 42
5.3. SFM-III 의 1차 서열 내에 S-S bond 유무 확인을 위한 DTT 처리 51
Ⅳ. 토 론 53
Ⅴ. 참 고 문 헌 65
감사의 글 69
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